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Oct 03, 2023

Gezielt und ganzheitlich

Band Kommunikationsbiologie

Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 619 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Mosambik ist eines der vier afrikanischen Länder, in denen mehr als die Hälfte aller Malaria-Todesfälle weltweit auftritt. Über die genetische Struktur des Parasiten in diesem Land ist jedoch wenig bekannt. Wir führten eine P. falciparum-Amplikon- und Gesamtgenomsequenzierung an 2251 Malaria-infizierten Blutproben durch, die 2015 und 2018 in sieben Provinzen Mosambiks gesammelt wurden, um Antimalaria-Resistenzmarker zu genotypisieren und die Struktur der Parasitenpopulation mithilfe genomweiter Mikrohaplotyen abzufragen. Hier zeigen wir, dass die einzigen Resistenz-assoziierten Marker, die bei Häufigkeiten über 5 % beobachtet wurden, pfmdr1-184F (59 %), pfdhfr-51I/59 R/108 N (99 %) und pfdhps-437G/540E (89 %) waren. Die Häufigkeit von pfdhfr/pfdhps-Fünffachmutanten, die mit einer Sulfadoxin-Pyrimethamin-Resistenz assoziiert sind, stieg von 80 % im Jahr 2015 auf 89 % im Jahr 2018 (p < 0,001), wobei eine geringere erwartete Heterozygotie und eine höhere Verwandtschaft der Mikrohaplotypen rund um die pfdhps-Mutanten im Vergleich zu Wildtyp-Parasiten darauf schließen lassen der aktuellen Auswahl. pfdhfr/pfdhps-Fünffachmutanten stiegen ebenfalls von 72 % im Norden auf 95 % im Süden (2018; p < 0,001). Dieser Resistenzgradient ging mit einer Konzentration von Mutationen bei pfdhps-436 (17 %) im Norden, einem Süd-Nord-Anstieg der genetischen Komplexität von P. falciparum-Infektionen (p = 0,001) und einer mikrohaplotypischen Signatur der regionalen Differenzierung einher . Die hier identifizierte Parasitenpopulationsstruktur bietet Einblicke als Leitfaden für Antimalaria-Interventionen und epidemiologische Untersuchungen.

Mosambik gehört mit geschätzten 10,2 Millionen Fällen im Jahr 20211 zu den zehn Ländern mit der höchsten Malariabelastung weltweit. Die Malariaübertragung ist im Land sehr heterogen, mit einer hohen Belastung im Norden und einer sehr geringen Übertragung im Süden, weshalb unterschiedliche Malariaerkrankungen erforderlich sind Strategien zur wirksamen Kontrolle und möglichen Eliminierung2. Die frühzeitige Behandlung einer Malariaerkrankung mit Artemisinin-basierten Kombinationstherapien (ACTs) und der Einsatz von Malariamedikamenten zur Prophylaxe und Prävention bleiben der Schlüssel zur Malariakontrolle und letztendlich zur Eliminierung der Malaria. Allerdings gefährden Resistenzen gegen Artemisinin3 und Partnermedikamente4 sowie gegen Sulfadoxin-Pyrimethamin (SP), das zur Chemoprävention5 eingesetzt wird, die weltweiten Bemühungen zur Reduzierung der Malarialast6.

Die Überwachung der Wirksamkeit von Malariamedikamenten ist von entscheidender Bedeutung, um das Risiko einer Resistenz gegen Malariamedikamente zu mindern und zu bewältigen4. Die Identifizierung molekularer Marker für Malariaresistenzen hat zu genetischen Ansätzen geführt, die Studien zur therapeutischen Wirksamkeit ergänzen können, die standardisierten Protokollen6,7 folgen, um Resistenzen zu bestätigen, Trends zu überwachen und Frühwarnsignale auszulösen6. Im Fall von Artemisinin wurde eine teilweise Resistenz (verzögerte Parasitenbeseitigung) mit Mutationen in der pfkelch13-Propellerregion in Verbindung gebracht3,6. In der Subregion Greater Mekong wurde das Auftreten dieser Mutationen mit Mutationen im ribosomalen Protein 10 des Apikoplasten von P. falciparum (pfarps10; PF3D7_1460900), Ferrodoxin (pffd, PF3D7_1318100), dem Chloroquin-Resistenztransporter (pfcrt; PF3D7_0709000) und der Multiresistenz in Verbindung gebracht 2 ( pfmdr2; PF3D7_1447900) Gene8. Kürzlich wurde die validierte pfkelch13-Mutation R561H in Ruanda9 und Tansania10 entdeckt, wohingegen A675V und C469Y in Uganda mit verlängerten Halbwertszeiten der Parasitenbeseitigung in Verbindung gebracht wurden11.

Die Entwicklung von Resistenzen gegen ACT-Partnermedikamente stellt weiterhin eine Herausforderung bei der Behandlung von Malaria dar4. Eine erhöhte Resistenz gegen Piperaquin wurde mit einer Genamplifikation eines Abschnitts von Chromosom 14 in Verbindung gebracht, an dem die Gene Plasmepsin 2 und 312 beteiligt sind, sowie mit Einzelnukleotidpolymorphismen in einem mutmaßlichen Exonukleasegen (pfexo, PF3D7_1362500) in Parasitenisolaten aus Kambodscha12. Mutationen im Multidrug-Resistance-Transporter-1-Gen (pfmdr1) (N86Y, Y184F und D1246Y) wurden mit der Anfälligkeit gegenüber mehreren Arzneimitteln in Verbindung gebracht, jedoch nicht vollständig validiert4,6, einschließlich Artesunat-Amodiaquin und Artemether-Lumefantrin13. Die K76T-Mutation bei pfcrt wurde zusammen mit verschiedenen Mutationssätzen an anderen Codons (einschließlich C72S, M74I, N75E, A220S, Q271E, N326S, I356T und R371I) mit Chloroquinresistenz in Verbindung gebracht4,6,14. Schließlich wurde das Versagen der klinischen Behandlung mit SP mit A437G- und K540E-Mutationen der Dihydropteroat-Synthase (pfdhps) in Kombination mit Dreifachmutationen (N51I + C59R + S108N) in der Dihydrofolat-Reduktase (pfdhfr) in Verbindung gebracht15. Es wurde vermutet, dass zusätzliche pfdhps-Mutationen (S436A/C/F/H und A581G) das Ausmaß der SP-Resistenz erhöhen16.

Die Identifizierung von Mutationen im Zusammenhang mit Arzneimittelresistenzen anhand routinemäßig entnommener Proben kann die Arzneimittelpolitik beeinflussen und sicherstellen, dass bei Interventionen geeignete Arzneimittelschemata zum Einsatz kommen. Seit der Ersetzung von Chloroquin durch eine Kombination aus Amodiaquin und SP zur unkomplizierten Malariabehandlung im Jahr 2003 wurden die nationalen Behandlungsrichtlinien Mosambiks mehrfach überarbeitet17. Im Jahr 2006 wurde ACT offiziell eingeführt, indem Artesunat/SP als Erstlinienbehandlung für unkomplizierte P. falciparum-Malaria eingeführt wurde. Die jüngste Änderung erfolgte im Jahr 2009, als das Land Artemether-Lumefantrin als offizielle Erstbehandlung einführte, mit Artesunat-Amodiaquin als Ersatz in Situationen, in denen Artemether-Lumefantrin kontraindiziert ist. Die intermittierende vorbeugende Behandlung in der Schwangerschaft (IPTp) mit SP wurde im Land erstmals im Jahr 2006 eingeführt und allen schwangeren Frauen kostenlos zur Verfügung gestellt18. Im Jahr 2014 wurden die nationalen Leitlinien aktualisiert und landesweit umgesetzt, um sie an die Empfehlung der Weltgesundheitsorganisation für ≥3 SP-Dosen anzupassen. Im Jahr 2015 ergab eine landesweite Haushaltsumfrage eine IPTp-SP-Länderabdeckung von 51,4 % für eine Dosis, 34,2 % für zwei Dosen und 22,4 % für ≥3 Dosen19. Derzeit testet das Land den Einsatz saisonaler (SP und Amodiaquin) und ganzjähriger (SP) Malaria-Chemoprophylaxe. Mehrere Studien haben über die Prävalenz molekularer Marker der Malariaresistenz in Mosambik berichtet14,20,21,22,23, es gibt jedoch keine umfassende Analyse ihrer räumlichen und zeitlichen Verteilung im Kontext der gesamten genetischen Struktur des Parasiten. In dieser Studie verwendeten wir amplikonbasierte Sequenzierung und Sequenzierung des gesamten Genoms, Ansätze des maschinellen Lernens sowie Verwandtschafts- und Diversitätsanalysen von Mikrohaplotypen, die pfdhps flankieren, um die räumliche und zeitliche Verteilung von Antimalaria-Resistenzmarkern und die geografische Struktur von P. falciparum zu beschreiben Parasiten und die Evolutionsgeschichte mutierter pfdhps-Allele in Proben, die 2015 und 2018 in Süd-, Zentral- und Nordmosambik gesammelt wurden.

Unter den 2251 P. falciparum-Proben, die in diese Studie einbezogen wurden, ergab die Sequenzierung in 1784 (79 %) Proben (455 aus dem Jahr 2015 und 1329 aus dem Jahr 2018; 308 aus North, 440 aus dem Norden) mindestens einen Resistenz-assoziierten Genotyp (unter 11 gezielten genetischen Markern). Zentral und 1034 aus Südmosambik; Abb. 1 und Ergänzungstabellen 1–3). Von diesen Proben stammten 1522 aus klinischen Malariafällen (therapeutische Wirksamkeitsstudien, Umfragen in Gesundheitseinrichtungen oder reaktive Überwachung), 200 aus Community-Umfragen (Massenverabreichung von Medikamenten, Querschnittsumfragen) und 62 von schwangeren Frauen bei ersten Besuchen in der Schwangerschaftsvorsorge (Ergänzungstabelle 1). Gesamtgenomsequenzen wurden aus insgesamt 1452 (64 %) Proben erhalten, die Qualitätsfilter passierten.

Die Tabellen geben die Anzahl der in die Analyse einbezogenen Proben pro Provinz und Jahr für jede der drei Hauptregionen des Landes an. Provinzgrenzen sind durch dicke Linien gekennzeichnet. Die einzelnen Bezirke, die Daten für die Studie bereitstellen, sind farbig markiert. Hergestellt mit QGIS.

Unter den 1429 P. falciparum-Proben, die erfolgreich für pfkelch13 genotypisiert wurden, waren 1393 vollständig Wildtyp-Proben und 36 (2,5 %) wiesen insgesamt 32 nicht-synonyme Mutationen auf, die nicht mit Artemisinin-Toleranz assoziiert sind (Tabelle 1). In einer Probe aus Südmosambik (2018) wurde eine Mutation im Codon 537 (N537D) beobachtet. Von den sechs Aminosäuren, die den genetischen Hintergrund der Artemisinin-Resistenz bilden, zeigte nur pfcrt N326Y eine Variation, wobei fünf Isolate von 1637 (0,3 %) einen gemischten Genotyp trugen (Tabelle 2). Ebenso wurden keine Mutationen am Codon 415 von Pfexo beobachtet, die mit einer Resistenz gegen Piperaquin verbunden waren (n = 1394). Der Plasmepsin2/3-Bruchpunkt wurde in 2 (0,4 %) von 524 P. falciparum-Isolaten nachgewiesen (Tabelle 2).

Mutationen an den Codons 72 (n = 1655), 74 (n = 1657), 75 (n = 1658), 76 (n = 1656) in pfcrt und an den Codons 86 (n = 1605) und 1246 in pfmdr1 (n = 1519) fehlten oder lagen unter 5 % (Tabelle 2). Im Gegensatz dazu trugen 59 % (899/1536) der getesteten Proben Mutationen am Codon 184 (534 reine Mutanten und 365 gemischte Genotypen; Ergänzungstabellen 4, 5). Es wurde kein statistisch signifikanter Unterschied bei der Übertragung dieser Mutation zwischen Provinzen oder Studienzeiträumen beobachtet (ergänzende Abbildung 1 und ergänzende Tabellen 6–8).

Mutationen an den Codons 164 in pfdhfr und 581 und 613 in pfdhps fehlten entweder oder lagen unter 1 % (Tabelle 2). Gemischte Genotypen wurden mit einer Häufigkeit von 1–2 % für 108, 51 und 59 pfdhfr-Codons und 5–11 % für 437 und 540 pfdhps-Codons beobachtet (Ergänzungstabelle 5). Nach Ausschluss dieser gemischten Genotypen betrug die Gesamthäufigkeit der Mutationen in pfdhfr ≥97 % (97 % in Codon 51 [1596/1638], 98 % in Codon 59 [1597/1625] und 99 % in Codon 108 [1635/1649]. ) und ≥88 % in pfdhps (90 % im Codon 437 [1289/1439] und 88 % im Codon 540 [1242/1404]; Ergänzungstabelle 6 und Ergänzungsabbildung 2). Die am häufigsten vorkommenden pfdhfr- und pfdhps-Allele waren die Dreifach- (S108N/N51I/C59R; 99 % [1548/1600]) bzw. Doppelmutanten (A437G/K540E; 89 % [1228/1377]) mit einem Anteil von 87 % (1155). /1330) von Fünffachmutanten (Ergänzungstabelle 6). Die Gesamthäufigkeit von Fünffachmutanten stieg von 80 % [234/293] im Jahr 2015 auf 89 % [921/1037] im Jahr 2018 (p < 0,001; Abb. 2a – c, Ergänzungstabelle 7 und Ergänzungsdaten 1), hauptsächlich in Cabo Delgado (von 40 bis 72 %, p < 0,001) und Gaza (von 90 bis 100 %, p < 0,001). Ähnliche Anstiege wurden für dreifache pfdhfr- und doppelte pfdhps-Mutanten beobachtet (p < 0,001). Die Häufigkeit von Fünffachmutanten nahm von Nord nach Süd zu, sowohl 2015 (40 % in Cabo Delgado vs. 93 % in Maputo; p < 0,001) als auch 2018 (72 % in Cabo Delgado vs. 95 % in Maputo; p < 0,001), hauptsächlich getrieben durch Unterschiede in den pfdhps-Doppelmutanten (Abb. 2a – c). Die multivariable logistische Regressionsanalyse zeigte, dass sowohl die Region (Nord, Mitte und Süden) als auch der Zeitraum (2015 und 2018) unabhängig voneinander mit der relativen Häufigkeit von pfdhfr/dhps-Mutationen verbunden waren, die von Norden nach Süden und von 2015 bis 2018 zunahm (Ergänzungstabelle). 8).

Häufigkeit von P. falciparum-Isolaten mit Dreifachmutationen in pfdhfr (a), Doppelmutationen in pfdhps (b) und Fünffachmutationen in pfdhfr/phdhps (c) in den Jahren 2015 und 2018 in sieben Provinzen Mosambiks. Für den pfdhps-Haplotyp 436/437/540 (d) werden Häufigkeiten der verschiedenen Allelkombinationen angezeigt (n = 1365). Die Häufigkeiten wurden nach Ausschluss gemischter Genotypen berechnet. Daten von Sofala waren nur für 2015 verfügbar, von Inhambane und Zambézia für 2018. Die Fehlerbalken stellen ein 95 %-Konfidenzintervall für den Bevölkerungsanteil dar.

Die Verteilung der Mutationen am Codon 436 (S436C/A/H/F) in pfdhps wies ein sehr ausgeprägtes geografisches Muster auf (Abb. 2d und ergänzende Daten 1). Nach Ausschluss gemischter Genotypen wurden Mutationen bei 436 in 17 % (40/232; C in 6, F in 5, H in 4 und A in 25) der aus Cabo Delgado erhaltenen Isolate beobachtet, jedoch nur in 0,6 % (8). /1307) der Isolate aus dem Rest des Landes und niemals in Kombination mit einem doppelten 437/540-Mutationshintergrund (Ergänzungstabelle 9). Daher wurden in Cabo Delgado drei verschiedene pfdhps-Haplotypen beobachtet: dreifacher Wildtyp (S436/A437/K540; 26/203 [13 %]), Mutant bei Codon 436, aber Wildtyp in den Codons 437 und 540 (37/203 [ 18 %]) und Wildtyp am Codon 436, aber mutiert in den Codons 437 und 540 (S436/A437G/K540E; 139/203 [68 %]). Im Gegensatz dazu war der Haplotyp S436/A437G/K540E im Rest des Landes vorherrschend (1089/1162 [94 %]; Ergänzungstabelle 9). Zwischen den Untersuchungszeiträumen wurde keine Änderung der Häufigkeit von Mutationen im Codon 436 beobachtet (p = 0,371; Ergänzungstabelle 8).

Insgesamt 8722 Mikrohaplotyp-Loci wurden durch lokale Assemblierung aus 1438 Proben rekonstruiert, die vollständige Genomsequenzen ergaben. Davon enthielten 349 Proben Daten für weniger als 50 Prozent aller Mikrohaplotyp-Loci (ergänzende Abbildung 3a) und wurden daher ausgeschlossen. Die mittlere erwartete Heterozygotie (He) der 8722 Mikrohaplotypen aus den 1089 Proben mit Daten für mehr als 50 % der Mikrohaplotypen betrug 0,312 (Interquartilbereich [IQR]: 0,196–0,498). 24 Prozent der Mikrohaplotypen wiesen eine hohe erwartete Heterozygotie (He > 0,5) in der analysierten Parasitenpopulation auf, und 366 hatten He > 0,75 (Abb. 3a und ergänzende Daten 1).

Mikrohaplotypen aus Regionen mit einer Länge von 150–300 bp zwischen langen Tandemwiederholungen wurden aus gesamten Genomsequenzen rekonstruiert und zum Testen der geografischen Struktur von P. falciparum-Parasiten verwendet. a Verteilung der erwarteten Heterozygotie an den 8722 Mikrohaplotyp-Loci, die aus gesamten Genomsequenzen extrahiert wurden. Die y-Achse stellt die Anzahl der Mikrohaplotyp-Loci für eine gegebene erwartete Heterozygotie dar. Die rote Linie markiert das 75 %-Perzentil der Verteilung; Für die Populationsstrukturanalyse wurden die 25 % der vielfältigsten Loci berücksichtigt. b Chromosomenstandorte der 155 wichtigsten Mikrohaplotypen, die zum geografischen Klassifizierungsmodell (Nord-Zentral-Süd) beitragen. c Hauptkoordinatenanalyse mit Proben, die in Regionen gruppiert sind (Nord-Zentral-Süd; n = 1089), unter Berücksichtigung von Mikrohaplotypen an Orten mit erwarteter Heterozygotie im oberen 25 %-Perzentil. d Hauptkoordinatenanalyse mit in Regionen gruppierten Proben unter Berücksichtigung der 155 besten Mikrohaplotypen mit einer Out-of-Bag-Fehlerrate bei der Klassifizierung von 24,89 %. e, f Komplexität der Infektion (COI) für Proben in verschiedenen Regionen Mosambiks in den Jahren 2015 (e) und 2018 (f), angezeigt durch die Anzahl genetisch unterschiedlicher Klone. Regionale Zuordnung der Proben: Norden: C. Delgado; Zentral: Sofala, Tete und Zambézia; Süden: Gaza, Inhambane und Maputo.

Die 25 % der vielfältigsten Mikrohaplotyp-Loci (n = 2181) wurden mithilfe einer Zufallswaldanalyse auf Provinz- und Regionalebene als Prädiktoren für die geografische Klassifizierung bewertet. Das Modell konnte die Proben nicht auf Provinzebene klassifizieren (Out-of-Bag-Fehlerrate = 50,51 %). Auf regionaler Ebene (Nord-Zentral-Süd; Abb. 3c, d und Ergänzungstabelle 10) betrug die Out-of-Bag-Fehlerquote jedoch 24,89 %. Die niedrigste Out-of-Bag-Fehlerrate wurde bei der Klassifizierung von Proben aus Nord und Süd beobachtet (8 %), und höhere Raten, wenn Proben aus der zentralen Region berücksichtigt wurden (15,26 % für Zentral-Süd und 36,79 % für Nord-Zentral; ergänzende Abb. 4). Die Entfernung von 155 Mikrohaplotypen führte dazu, dass das Modell unterhalb des Wendepunkts der Verteilung der mittleren Abnahme der Genauigkeit an Genauigkeit bei der Vorhersage der regionalen Klassifizierung verlor (ergänzende Abbildung 3b) und daher als am relevantesten angesehen wurde. Einunddreißig Prozent dieser Mikrohaplotypen befanden sich auf Chromosom 6, gefolgt von Prozentsätzen unter 10 % auf den übrigen Chromosomen (Abb. 3b und ergänzende Daten 1).

Die Gesamtkomplexität von P. falciparum-Infektionen innerhalb des Wirts, berechnet aus den 100 Mikrohaplotypen mit dem höchsten He, betrug 2 (IQR [1,2]) mit einer Prävalenz von 47 % (517/1090) monogenomischer Infektionen. Die Komplexität der Infektion (COI) und die Prävalenz monoklonaler Infektionen waren im Jahr 2015 in den drei Regionen Mosambiks ähnlich (p = 0,801 bzw. p = 0,507). Allerdings unterschied sich der mittlere COI im Jahr 2018 zwischen den drei Regionen (p < 0,001), mit den niedrigsten Werten im Süden (1, IQR [1,2]), gefolgt vom Zentrum (2, IQR [1,2]) und Norden (2, IQR [1,3]). Ähnliche Trends wurden bei der Prävalenz monogenomischer Infektionen beobachtet (51 % im Süden, 46 % im Zentrum und 35 % im Norden; p = 0,005; Abb. 3e, f, Ergänzungstabellen 8, 11 und Ergänzungsdaten 1). ).

Mikrohaplotypen, die pfdhps flankieren, wurden verwendet, um die Evolutionsgeschichte der mutierten Allele in Cabo Delgado abzuleiten, da die Doppelmutanten wie in den übrigen Provinzen fast die Fixierung erreicht hatten (Häufigkeiten zwischen 80 und 100 %). Sechzehn Mikrohaplotypen waren in einer 50-kb-Region um das Gen pfdhps enthalten, 15 davon in acht Genen und einem intergenen (ergänzende Abbildung 5). Diese flankierenden Mikrohaplotypen trennten die Parasiten, die den doppelten mutierten pfdhps-Haplotyp (immer begleitet von einem Wildtyp-436-Codon) trugen, vom Rest der Parasiten (Abb. 4a, b und ergänzende Daten 1). Die 50-kb-Region, die pfdhps flankiert, war bei Doppel-pfdhps-Mutanten (n = 92; mittlere Identität nach Bundesstaat [IBS] = 0,88, IQR [0,81–0,91]) ähnlicher als bei Doppel-Wildtyp-Mutanten (n = 51, mittleres IBS =). 0,68, IQR[0,62–0,76]; p < 0,001; ergänzende Abbildung 6). In ähnlicher Weise war He von Mikrohaplotypen, die pfdhps flankieren, in den Doppelmutanten um 60 % niedriger (Median = 0,1, IQR[0,04–0,26]) als in Wildtyp-Allelen (Median = 0,34, IQR[0,21–0,41]; p = 0,016; Abb . 4c, Ergänzungstabelle 12 und Ergänzungsdaten 1), im Einklang mit der jüngsten Auswahl.

Die Identifizierung nach Bundesstaat (IBS) und erwarteter Heterozygotie (He) wurde unter Verwendung von 16 Mikrohaplotypen, die pfdhps flankieren, berechnet, um die Evolutionsgeschichte mutierter pfdhps-Allele in Mosambik zu bewerten. eine Heatmap der Inter-Subpopulations-IBS-Matrix unter dhps-Allelen in Cabo Delgado, beobachtet in den Jahren 2015 und 2018 (Wildtyp in den Codons 436, 437 und 540 [WT/WT/WT]: n = 20; Mutante in Codon 436 aber Wildtyp in den Codons 437 und 540 [MUT/WT/WT]: n = 31; Wildtyp in Codon 436, aber mutant in den Codons 437 und 540 [WT/MUT/MUT]: n = 92). Sechzehn Mikrohaplotypen in einer 50-kb-Region um pfdhps wurden zur Berechnung des paarweisen IBS zwischen Proben verwendet. b T-verteilte stochastische Nachbareinbettungsvisualisierung nach 10.000 Iterationen und c Erwartete Heterozygotie, berechnet aus den 16 Mikrohaplotyp-Loci in einer 50-kb-Region um pfdhps in Parasiten, die aus Cabo Delgado gesammelt wurden. Median und Interquartil (IQR) He-Werte: 0,1, IQR (0,04–0,26) für Doppelmutanten; 0,37, IQR (0,2–0,47) für WT/WT/WT; und 0,28, IQR (0,13–0,4) für MUT/WT/WT. Die unteren, mittleren und oberen Scharniere des Rechtecks ​​entsprechen dem 25-%-Quantil, dem Median bzw. dem 75-%-Quantil der Verteilung.

Diese Studie liefert eine landesweite Auflösung der P. falciparum-Marker der Antimalariaresistenz und der genetischen Struktur in Mosambik, die als Grundlage für den Einsatz von Antimalariamitteln zur Behandlung und Chemoprävention sowie zur Untersuchung der Auswirkungen zukünftiger Interventionen dienen kann. Die genomischen Daten liefern Hinweise darauf, dass: (1) obwohl nicht-synonyme Mutationen in pfkelch13 beobachtet wurden, keine davon mit Artemisinin-Toleranz in Verbindung gebracht wurde; (2) genetische Varianten im Zusammenhang mit Piperaquin- und Chloroquin-Resistenz waren im Jahr 2018 selten; (2) Im Gegensatz dazu nahm die Häufigkeit von pfdhfr/dhps-Mutationen von Norden nach Süden zu und erreichte in der Provinz Maputo fast die Fixierung; und (3) dieser räumliche Trend ging einher mit einer Verringerung der genetischen Komplexität von P. falciparum-Infektionen nach Süden und einem Signal der geografischen Differenzierung, das eine regionale Trennung auf der Grundlage sehr unterschiedlicher Mikrohaplotypen ermöglicht.

Der Artemisinin-empfindliche Wildtyp-Haplotyp pfkelch13 dominierte in der untersuchten Parasitenpopulation aus Mosambik, und keine der validierten Artemisinin-resistenten Varianten wurde nachgewiesen6. Allerdings wurde eine Reihe von 32 seltenen nicht-synonymen Mutationen identifiziert, ähnlich den Ergebnissen anderer Studien in Afrika24. Darunter wurde in einer Probe die N537D-Mutation nachgewiesen, von der berichtet wurde, dass sie möglicherweise mit einer verzögerten Clearance assoziiert ist24, während A578S, die vorherrschende pfkelch13-Mutation in P. falciparum-Parasiten afrikanischen Ursprungs24, aber nicht mit Artemisinin-Toleranz assoziiert, in gefunden wurde vier der 1429 genotypisierten Proben. Die Hintergrundmutationen, die das Auftreten von pfkelch13-Mutationen in Südostasien vorwegnahmen8, wurden in dieser Studie nicht entdeckt. Ebenso gibt es keine eindeutigen Hinweise auf Polymorphismen, die mit einer Resistenz gegen ACT-Partnermedikamente verbunden sind. Nur 0,4 % der analysierten Proben zeigten Hinweise auf eine Piperaquin-Resistenz, basierend auf der Analyse des Bruchpunkts innerhalb des distalen Endes von Plasmepsin 325, der mit Plasmepsin-2/3-Duplikationen und dem Einzelnukleotid-Polymorphismus am Codon 415 des mutmaßlichen Exonuklease-Gens assoziiert ist12. Dies steht im Einklang mit einer früheren Studie in Mosambik, in der in 1,1 % der analysierten Proben mehrere Kopien von Plasmepsin 2 gefunden wurden21. Mutationen im Codon 86 von pfmdr1, die mit einer Resistenz gegen Amodiaquin und einer erhöhten Anfälligkeit für Lumefantrin26,27 verbunden sind, wurden in 11 der 1605 analysierten Proben festgestellt. Neunundfünfzig Prozent der Parasiten trugen die 184 F pfmdr1-Variante, obwohl diese Mutation in vivo28,29 und in vitro26 einen schwächeren Zusammenhang mit der Wirksamkeit gegen Malaria zu haben scheint. Allerdings müssen pfmdr1-Marker aufgrund inkonsistenter Assoziationen mit der Arzneimittelresistenz von ACT-Partnern mit Vorsicht betrachtet werden30, was darauf hinweist, dass robuste molekulare Marker im Zusammenhang mit Amodiaquin und Lumefantrin immer noch fehlen.

Die vorliegende Studie enthüllte einen evolutionären Prozess, der auf die molekularen Marker der SP-Resistenz einwirkt. Insgesamt wurde eine hohe Häufigkeit von dreifachen pfdhfr- (99 %), doppelten pfdhps- (89 %) und fünffach mutierten Haplotypen (87 %) beobachtet, die von 2015 bis 2018 und von Norden nach Süden zunahm. Mikrohaplotypen in der 50-kb-Region um die mutierten pfdhps-Allele herum waren ähnlicher (höheres Reizdarmsyndrom) und weniger vielfältig (geringere erwartete Heterozygotie) als um das Wildtyp-Allel, was auf eine kürzliche Ausweitung der Doppelmutantenpopulation im Land hindeutet31. Geografische Heterogenitäten in der Prävalenz von pfdhfr/dhps-Alelen gingen mit einer unterschiedlichen Verteilung der pfdhps-436-Mutation einher, die nur im Norden des Landes (Cabo Delgado) mit einer Häufigkeit von 17 % und nie in Kombination mit der doppelten 437-Mutation nachgewiesen wurde und 540 mutierte Haplotypen. Veränderungen am Codon 436 wurden mit einem höheren Grad an In-vitro-SP-Resistenz in Verbindung gebracht32, obwohl In-vivo-Resistenznachweise weniger eindeutig sind33. Die Zunahme der pfdhps-Mutationen von Nord nach Süd ging auch mit einer Verringerung der Anzahl genetisch unterschiedlicher Parasitenstämme einher, die ein Individuum infizierten, was auf eine abnehmende Intensität der Malariaübertragung hinweist34. Schließlich fiel das pfdhps-Mutationsmuster auch mit einer regionalen Trennung der Parasitenpopulation auf der Grundlage sehr unterschiedlicher Mikrohaplotypen zusammen, was auf eine geografische Strukturierung hindeutet. Geografische Entfernung, Hindernisse im Genfluss zwischen den Regionen und Unterschiede in der Abdeckung von Antimalaria-Interventionen35 aufgrund ungleicher Verteilung von Ressourcen und Sicherheitsproblemen könnten zur regionalen Differenzierung der Mikrohaplotypen beigetragen haben, was sich möglicherweise auf die in den molekularen Markern beobachteten geografischen Muster ausgewirkt hat des SP-Widerstands. Es ist jedoch immer noch unklar, welche selektiven Kräfte die Verbreitung von pfdhfr/dhps-Mutanten vorangetrieben haben, da diese nicht in großem Maßstab eingesetzt wurden, da Mosambik SP 2009 zugunsten der klinischen Verwaltung aufgegeben hat. Kompensationsmechanismen, die die Kosten für die Mutationsfitness reduzieren36 oder ein unzureichender Pool von empfindlichen Parasiten auf die Kraftstoffrückgewinnung37, könnte zum Anstieg der pfdhfr/pfdhps-Mutanten ohne SP-Medikamentendruck beigetragen haben. Dies waren jedoch keine einschränkenden Faktoren für die Wiederherstellung der Chloroquin-Empfindlichkeit in Mosambik, wo die Mutationen in pfcrt nahezu fixiert waren38. Der Beitrag von SP zum Drogendruck durch IPTp oder andere Medikamente wie Cotrimoxazol39,40 dürfte gering sein, da die Zielpopulationen zu einem bestimmten Zeitpunkt nur einen kleinen Teil der Gesamtbevölkerung Mosambiks ausmachen. Schließlich könnte auch ein geringeres Maß an Antimalaria-Immunität und sexueller Rekombination zur Aufhebung der Verknüpfung von Resistenz-Haplotypen zur höheren Verbreitung molekularer Marker der SP-Resistenz im Süden Mosambiks beigetragen haben, wo die Malariaübertragung am niedrigsten ist41. Obwohl diese Muster mit der Richtungsauswahl aufgrund des Drogendrucks im Einklang zu stehen scheinen, lässt die Art der Studie es nicht zu, andere Faktoren außer Acht zu lassen, wie beispielsweise die regionalen Auswirkungen der Drogenpolitik der Nachbarländer42.

Die Ergebnisse dieser Studie haben mehrere Auswirkungen auf die öffentliche Gesundheit. Erstens legen alle verfügbaren In-vivo-Wirksamkeitsdaten7,43,44 und das Fehlen validierter Kelch13-Mutationen im Jahr 2018 die angemessene Wirksamkeit von Artemisinin zur Behandlung von P. falciparum und die Verringerung der Malariaübertragung in Mosambik nahe. Allerdings könnte das breite Spektrum seltener, nicht-synonymer Mutationen, die entdeckt wurden, möglicherweise ein umfangreiches Reservoir an Variationen für die Entstehung einer Artemisinin-Toleranz darstellen45, wie kürzlich in Ruanda und Uganda berichtet wurde9,11. Zweitens legen das Fehlen von Mutationen am Codon 415 von Pfexo und die geringe Prävalenz der nachgewiesenen Plasmepsin2/3-Bruchpunkte (0,4 %) die angemessene Leistung von Piperaquin als ACT-Partnermedikament nahe. Allerdings sollte die Plasmpesin2/3-Genamplifikation angesichts der raschen Entstehung und Ausbreitung von Piperaquin-Resistenzen in Südostasien, die zu hohen Behandlungsversagensraten nach einer Dihydroartemisinin-Piperaquin-Behandlung führt, genau überwacht werden12. Drittens bestätigen die Daten die Verwendung von SP zur Chemoprävention trotz des hohen Anteils von pfdhps- und pfdhfr-Fünffachmutanten, da es keine Hinweise auf einen Zusammenhang zwischen molekularen Markern und der chemopräventiven Wirksamkeit gibt5,46. Darüber hinaus wurde die pfdhps-A581G-Mutation, von der vermutet wird, dass sie die chemopräventive Wirksamkeit von SP bei Säuglingen und schwangeren Frauen verringert47,48,49, nur in drei der 1490 (0,2 %) analysierten Proben nachgewiesen, was die weitere Verwendung von unterstützt SP für IPTp in Mosambik. In ähnlicher Weise dürfte die Wirksamkeit von Amodiaquin für die Chemoprävention saisonaler Malaria akzeptabel hoch bleiben, da die Mutationen 72–76 in pfcrt und der 86Y–184Y-Haplotyp von pfmdr1 sehr niedrig sind und für eine klinisch relevante Resistenz gegen Amodiaquin in Afrika als notwendig erachtet werden50,51 . Viertens legen die sehr geringe Prävalenz (0,6 %) der Marker der Chloroquin-Resistenz bei pfcrt und die Hinweise auf eine Rückkehr seiner therapeutischen Wirksamkeit in Mosambik38 zusammen mit seiner chemoprophylaktischen Aktivität und seinem Sicherheitsprofil nahe, dass Chloroquin allein eine Rolle spielen könnte oder in Kombination mit anderen Medikamenten oder Hilfsmitteln, zur Chemoprävention auf Bevölkerungsebene oder für derzeit ungeschützte Bevölkerungsgruppen wie schwangere Frauen im ersten Trimester52. Fünftens können Mikrohaplotypen, die auf die regionale Bevölkerungsstruktur hinweisen, nützlich sein, um einen breit angelegten Parasitenfluss oder die Zuordnung der geografischen Herkunft in Mosambik zu identifizieren. Das Fehlen einer feineren Bevölkerungsstruktur auf Provinzebene kann diesem Ansatz jedoch einige Einschränkungen auferlegen, die möglicherweise besser ausgewertet werden könnten, indem Unterschiede in der paarweisen Verwandtschaft von Parasiten im Gegensatz zur regionalen Differenzierung in den Allelfrequenzen ausgenutzt werden53,54. Diese hochgradig unterschiedlichen Mikrohaplotyen können auch nützlich sein, um Metriken für die genetische Diversität von Parasiten zu entwickeln, um Änderungen in der Übertragungsintensität zu erkennen und die Wirksamkeit von Antimalaria-Interventionen zu überwachen34. Sechstens zeigt diese Studie auch den Nutzen der Sekundäranalyse von Blutproben aus anderen Studien zur Beschreibung molekularer Muster von Überwachungsinteresse. Und schließlich unterstreicht die Heterogenität der molekularen Marker der Malariaresistenz in Mosambik die Notwendigkeit, bei der Extrapolation von Umfrageergebnissen von einem einzelnen Standort Vorsicht walten zu lassen.

Die Studie weist mehrere Einschränkungen auf. Erstens stellen die ausgewerteten getrockneten Blutflecken eine Zufallsprobe aus verschiedenen Studien dar, was zu Heterogenitäten im Alter, im klinischen Status der Personen und in der Übertragungsintensität führt, die sich auf den Grad der Immunität und die Behandlungsaufnahme auswirken könnten. Während weitere Arbeiten erforderlich sind, um die Auswirkungen dieser Faktoren zu quantifizieren, stellen diese Heterogenitäten diejenigen dar, die in einem Land wie Mosambik zu finden sind, wo die Malariaübertragung von einer sehr hohen Belastung im Norden bis zu einer sehr geringen im Süden reicht. Zweitens kann der Ausschluss gemischter Wildtyp-resistenter Infektionen zur Berechnung der Häufigkeit von Resistenz-Haplotypen die Resistenzschätzungen verzerren55. Drittens können andere selektive Kräfte als diejenigen, die durch die Verwendung von Antimalariamitteln hervorgerufen werden, nicht außer Acht gelassen werden, da die Signale der jüngsten Selektion mithilfe von Mikrohaplotypen in der 50-kb-Region um pfdhps abgeleitet wurden, die kodierende Regionen anderer Gene überlappen. Schließlich ist Vorsicht geboten, wenn auf die Behandlung und die chemopräventive Wirksamkeit eines Malariamittels geschlossen wird, die von anderen Faktoren als der intrinsischen Parasitenanfälligkeit abhängen, wie z. B. der vom Patienten erworbenen Immunität, der anfänglichen Parasitenbiomasse, der Einhaltung der Behandlung, der Dosierung, der Arzneimittelqualität und der Pharmakokinetik6. Allerdings spielen Informationen über molekulare Marker eine wichtige Rolle bei der Verfolgung von Resistenzen und sollten genutzt werden, um Frühwarnsignale zu erkennen56. Zur Bewertung SP-basierter chemopräventiver Strategien ist die Kombination von Wirksamkeitsstudien zur Chemoprävention57 mit der Überwachung von pfdhps-Mutationen erforderlich.

Zusammenfassend zeigt dieser Bericht genetische Nord-Süd-Signale zunehmender molekularer Auslöser von SP-Resistenzen, abnehmender genetischer Komplexität von Infektionen und geografischer Differenzierung in Mosambik. Die sehr geringe Prävalenz von 581 Mutationen in pfdhps bestätigt jedoch die Rolle von SP für die Chemoprävention in Mosambik. Ebenso wurden in Mosambik keine molekularen Signale einer Artemisinin-Toleranz beobachtet. Diese Ergebnisse liefern Basisdaten für die Untersuchung der Entwicklung von P. falciparum-Parasiten als Reaktion auf sich ändernde nationale Malaria-Behandlungsrichtlinien. Darüber hinaus veranlassen diese Erkenntnisse die Integration molekularer Überwachungssysteme in Studien zur Wirksamkeit von Behandlung und Chemoprävention, um die Entstehung und Ausbreitung von Arzneimittelresistenzen in Mosambik zu verfolgen. Um dies zu erreichen, ist die Beseitigung von Ineffizienzen bei der Probenahme und Sequenzierung sowie finanzielle Unterstützung und eine angemessene Nutzung der generierten Daten erforderlich, um die Nachhaltigkeit der molekularen Überwachungsprogramme für Malaria sicherzustellen58.

Diese Studie analysierte 2251 Proben, die 2015 (n = 724) und 2018 (n = 1527) aus 40 Distrikten in sieben Provinzen Mosambiks gesammelt wurden (Ergänzungstabellen 1, 2): eine in der Nordregion (Cabo Delgado), drei in der Mitte Region (Zambézia, Sofala und Tete) und drei im Süden (Gaza, Inhambane und Maputo; Abb. 1). Getrocknete Blutflecken wurden von mit P. falciparum infizierten Personen gesammelt, die im Rahmen von sechs Malaria-Beobachtungsstudien und klinischen Studien in den Jahren 2015 und 2018 identifiziert wurden7,43,59,60,61. Im Jahr 2018 wurden in zwei Umfragestudien zu Gesundheitseinrichtungen Personen rekrutiert, die ambulante Dienste in Maputo, Zambézia, Cabo Delgado, Inhambane und Gaza in Anspruch nehmen (alle Altersgruppen)59,60. Proben aus zwei weiteren Studien zur therapeutischen Wirksamkeit umfassten Kinder unter 5 Jahren mit bestätigter Malaria (durch schnelle Diagnosetests) in den Provinzen Cabo Delgado, Tete, Sofala und Gaza im Jahr 201543 und in Cabo Delgado, Tete, Zambézia und Inhambane im Jahr 20187 ). In der fünften Studie wurden alle Altersgruppen mit einem Malaria-positiven Schnelldiagnosetest durch gemeindebasierte Querschnittsumfragen in der Provinz Maputo (2015 und 2018)61 identifiziert, einschließlich eines Malaria-Beseitigungsprojektgebiets61, das Proben von teilnehmenden Personen sammelte Massenkampagnen zur Drogenverabreichung und reaktive Überwachung im Bezirk Magude. Schließlich wurden in der sechsten Studie schwangere Frauen bei ihrem ersten Besuch in der Schwangerschaftsvorsorge mit einer durch quantitative Echtzeit-PCR bestätigten P. falciparum-Infektion durch in der Provinz Maputo durchgeführte Umfragen zur Schwangerschaftsvorsorge identifiziert (2018)62. Bei den Probenahmestellen in Gesundheitseinrichtungen handelte es sich um Bezirks- oder Unterbezirksgesundheitszentren oder Provinzkrankenhäuser, die vom Centro de Investigação em Saúde de Manhiça (CISM) oder dem National Malaria Control Program entsprechend ihrem öffentlichen Gesundheits- oder Forschungsbedarf ausgewählt wurden, wohingegen Querschnittsumfragen gemeinschaftlich durchgeführt wurden -basiert und die Teilnehmer wurden zufällig ausgewählt. Weitere Informationen zur Probenahme für jede Studie finden Sie in den zugehörigen Publikationen. Vor der Behandlung wurden von jedem Patienten durch Einstechen in den Finger 50 μl getrocknete Blutflecken auf Filterpapier entnommen, mit anonymen Barcodes identifiziert und bei 4 °C mit Kieselgel gelagert.

Klinisch-demografische Daten und Blutproben wurden nur nach schriftlicher Einverständniserklärung aller Teilnehmer oder einer erwachsenen Begleitperson, sofern diese jünger als 18 Jahre alt war, gesammelt. Alle Studienprotokolle wurden vom mosambikanischen Nationalkomitee für Bioethik im Gesundheitswesen genehmigt. Die Forschung umfasste lokale Forscher während des gesamten Forschungsprozesses, einschließlich des Studiendesigns, der Studiendurchführung, des Dateneigentums, des geistigen Eigentums und der Urheberschaft der Veröffentlichung. Die Forschung ist lokal relevant, wie in Zusammenarbeit mit lokalen Partnern festgestellt wurde, die sich über die Bedeutung der molekularen Überwachung von Malaria einig waren. Rollen und Verantwortlichkeiten wurden zwischen den Mitarbeitern vor der Umsetzung der Forschungsaktivitäten vereinbart. Besonderes Augenmerk wurde auf den Kapazitätsaufbau für lokale Forscher im Bereich genomischer und bioinformatischer Tools für die molekulare Überwachung gelegt.

DNA wurde aus Proben im MalariaGEN-Labor am Wellcome Sanger Institute, Hinxton, Großbritannien, mithilfe von Hochdurchsatz-Robotergeräten (Qiagen QIAsymphony)63 extrahiert. Die Parasiten-DNA wurde durch Anwendung der selektiven Amplifikation des gesamten Genoms amplifiziert und die Genotypisierung wurde von der SpotMalaria-Plattform63 durchgeführt. Kurz gesagt wurde eine erste PCR durchgeführt, um 190–250 bp große Amplikons von Interesse im Parasitengenom zu erzeugen, wobei ortsspezifische Multiplex-Primer verwendet wurden, gefolgt von einer zweiten PCR, um einzigartige Multiplexing-Adapter auf Probenebene und Primer-Pool zu integrieren. Nach der Sequenzierung mehrerer Proben auf einer einzelnen MiSeq-Spur wurden die Sequenzen mithilfe der eindeutigen Multiplexing-Adapter-IDs deplexiert und mit einem modifizierten Amplikon-P. falciparum-Referenzgenom abgeglichen. Genotypen wurden für jede mit bcftools und benutzerdefinierten Skripten63 analysierte Variante aufgerufen, nämlich: pfkelch13 (jede Mutation in den Codons 349–726, die BTB/POZ- und Propellerdomänen entspricht)64, pfdhfr (Codons 51, 59, 108, 164)15, pfdhps ( Codons 436, 437, 540, 581, 613)16, pfcrt (Codons 72, 73, 74, 75, 76)4,6,14, pfexo (Codon 415)12, pfmdr1 (Codons 86, 184, 1246)13, und genetischer Hintergrund der Artemisinin-Resistenz (Codons 127, 128 in pfarps10, 193 in pffd, 326, 356 in pfcrt und 484 in pfmdr2)8. Ein Assay zum Nachweis des Bruchpunkts innerhalb des distalen Endes von Plasmepsin 3, der die vollständige Duplikation des Plasmepsin 2-Gens (Plasmepsin2/3-Bruchpunkt) umfasst, wurde zum Nachweis der Hybridsequenz verwendet, die als Ergebnis der Plasmepsin 2/3-Duplikation entstanden ist25.

P. falciparum-Proben wurden außerdem am Wellcome Sanger Institute und an der University of California, San Francisco, im gesamten Genom sequenziert. Kurz gesagt, kurze Sequenzablesungen (200 bp) wurden auf der Illumina HiSeqX-Plattform am Wellcome Sanger Institute65 generiert. An der University of California, San Francisco, wurden Barcode-Bibliotheken, die mit dem NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit nach selektiver Amplifikation des gesamten Genoms66 erstellt wurden, gepoolt und auf dem Illumina NovaSeq 6000 System unter Verwendung einer 150-bp-Paired-End-Sequenzierung sequenziert. Lesevorgänge wurden für eine Mindestqualität pro Basis von 20 gefiltert. Variantenaufrufe wurden durch Ausführen eines benutzerdefinierten Pileup-Programms generiert und so gefiltert, dass sie eine Mindestlesetiefe von 10 und eine Mindesthäufigkeit innerhalb der Stichprobe von 5 % aufwiesen, die durch Verwendung von selektivem Ganzen generiert wurden Die Genomamplifikationskontrolle wird an bekannten Laborstämmen durchgeführt, um alle falschen Variantenaufrufe zu entfernen.

Die Analyse zielte darauf ab, die räumliche und zeitliche Verteilung von Antimalaria-Resistenzmarkern, die geografische Struktur von P. falciparum-Parasiten und die Evolutionsgeschichte von pfdhps-mutierten Allelen zu beschreiben. Die Häufigkeit von Infektionen, die Parasiten mit Markern einer Antimalariaresistenz übertragen, wurde auf Provinzebene basierend auf dem Probenahmeort und dem Jahr geschätzt. Für jedes Codon wurden die Proben als Wildtyp-, Mutanten- oder gemischte Proben klassifiziert, wenn sowohl Wildtyp- als auch Mutanten-Allele nachgewiesen wurden, oder als fehlend, wenn die Proben keinen gültigen Genotyp ergaben. Proben ohne gemischte Genotypen wurden für die Haplotyp-Rekonstruktion und die anschließende statistische Analyse aufbewahrt. Ein lokales Haplotyp-Rekonstruktionstool (Pathweaver67) wurde verwendet, um Mikrohaplotypen aus Regionen mit einer Länge von 150–300 bp zwischen langen Tandemwiederholungen zu extrahieren. Mikrohaplotypen wurden so ausgewählt, dass sie keine Homopolymere/Dinukleotidwiederholungen mit einer Länge von mehr als 10 bp oder Längenvariationen von >3 bp und mindestens zwei Einzelnukleotidpolymorphismen enthalten60. Proben, bei denen mehr als 50 % der Mikrohaplotyp-Loci fehlten, wurden von nachfolgenden Analysen ausgeschlossen.

Die erwartete Heterozygotie (He) an einem Ort wurde unter Verwendung des benutzerdefinierten R-Codes als \({{{{{{\rm{H}}}}}}}_{{{{{{\rm{e}}}}} berechnet. }}=[\frac{n}{n-1}][1-\sum {p}^{2}]\) (Gleichung 1), wobei n die Anzahl der Proben und p die Allelhäufigkeit von ist jedes Mikrohaplotyp-Allel am Locus. Die Varianz von He wurde nach der Formel berechnet: \(2(n-1)/{n}^{3}\{2(n-2)[\sum {\left(\right.{p}^{ 3}-(\sum {p}^{2})}^{2}]\}\) (Gleichung 2). Die Wirtskomplexität von P. falciparum-Infektionen wurde mithilfe eines Markov-Ketten-Monte-Carlo-Ansatzes aus berechnet 100 Mikrohaplotypen mit dem höchsten He-Wert (R-Paket MOIRE, https://github.com/EPPIcenter/moire). Monogenomische Infektionen wurden berücksichtigt, wenn die Komplexität der Infektion eins betrug. Die geografische Struktur wurde mithilfe der Random-Forest-Klassifizierung68 (R-Paket randomForest, mit ntree = 2500) auf Mikrohaplotypen mit He im oberen 25. Perzentil als Prädiktoren und dem geografischen Standort (Provinz und Region) als Ergebnis. Für die ersten Tests wurden ausgewogene Trainingsdatensätze (die 75 % der Daten darstellen) und Testdatensätze ( Die restlichen 25 % der Daten wurden zur Berechnung der Out-of-Bag-Fehlerrate des Klassifizierungsmodells verwendet. Eine Out-of-Bag-Fehlerrate von weniger als 25 % wurde als einigermaßen gute Klassifizierung angesehen. Die Visualisierung der Klassifizierung erfolgte durch eine Hauptkoordinatenanalyse der Proximity-Matrix. Mikrohaplotypen in der 50-kb-Region, die pfdhps flankiert, wurden verwendet, um auf die Evolutionsgeschichte mutierter Allele zu schließen. Die Populationsstruktur wurde mithilfe der t-verteilten stochastischen Nachbareinbettung visualisiert, die das Vorhandensein/Fehlen eines Mikrohaplotyps berücksichtigt, der mit dem R-Paket Rtsne mit 10.000 Iterationen berechnet wurde. Die Verwandtschaft zwischen den Proben wurde durch paarweise IBS bewertet, berechnet als \(\frac{1}{n}\mathop{\sum }\limits_{i=1}^{n}{Si}/{XiYi}\) (Gleichung 3) , wobei n die Anzahl der Loci ist, Si die Anzahl der Mikrohaplotyp-Allele ist, die von den Proben am Ort i gemeinsam genutzt werden, und Xi und Yi die Anzahl der Mikrohaplotyp-Allele am Ort i der Proben X bzw. Y sind. Chi-Quadrat-Test- und logistische Regressionsmodelle wurden verwendet, um die Häufigkeit von Resistenzmarkern zwischen Regionen und Untersuchungszeiträumen zu vergleichen. He-Unterschiede zwischen pfdhps-Haplotypen an einzelnen Mikrohaplotyp-Loci wurden durch einen Permutationstest getestet, bei dem die Bezeichnungen der Subpopulationen 1000 Mal an jedem Mikrohaplotyp-Locus zufällig gemischt wurden69. Für den Vergleich der Verteilung von He und IBS zwischen Populationen wurde der Kruskal-Wallis-Rangsummentest verwendet, mit Dunn-Test und Bonferroni-Korrektur für mehrere Tests in paarweisen Vergleichen.

Diese Studie analysierte 2251 Proben aus 40 Distrikten in sieben Provinzen Mosambiks. Unter diesen ergab die Sequenzierung in 1784 Proben, die für die statistische Analyse einbezogen wurden, mindestens einen Resistenz-assoziierten Genotyp. Aus insgesamt 1452 Proben, die Qualitätsfilter passierten, wurden vollständige Genomsequenzen erhalten. Statistische Analysen wurden in Stata Version 15.0 und R Version 4.1.2 durchgeführt. Alle gemeldeten p-Werte sind zweiseitig und ein ap-Wert von weniger als 0,05 wurde als Hinweis auf statistische Signifikanz angesehen.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die Sequenzen wurden im European Nucleotide Archive (ENA) unter dem Projektnamen PRJEB2136 und im Sequence Read Archive (SRA) unter der BioProject ID PRJNA910151 hinterlegt. Ein anonymisierter und eingeschränkter Datensatz kann auf genehmigte Anfrage nach Abschluss einer Datennutzungsvereinbarung per E-Mail an den entsprechenden Autor bereitgestellt werden. Die Quelldaten für alle Diagramme finden Sie in Supplementary Data 1 und Figshare (https://figshare.com/s/1920d5bad8268218b480 [Abb. 3c] und https://figshare.com/s/464a6825e09691aec654 [Abb. 3d]).

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Besonderer Dank gilt den Studienteilnehmern, die Blutproben für die molekulare Analyse gespendet haben, sowie den Ärzten und Krankenschwestern, die bei der Daten- und Probenentnahme geholfen haben. Diese Arbeit wurde von der Bill and Melinda Gates Foundation (INV-019032 und OPP1132226), dem National Institute of Health (1R01AI123050) und dem Departament d'Universitats i Recerca de la Generalitat de Catalunya (AGAUR; 2021SGR01517 und 2022FIB00148 Stipendium für SB) unterstützt. , Ministerio de Ciencia e Innovación in Spanien (PID2020-118328RB-I00), das Forschungs- und Innovationsprogramm Horizont 2020 der Europäischen Union im Rahmen des Marie-Skłodowska-Curie-Programms (Zuschuss 890477) und die US-Agentur für internationale Entwicklung im Rahmen der Malaria-Initiative des US-Präsidenten. CISM wird von der Regierung Mosambiks und der spanischen Agentur für internationale Entwicklung (AECID) unterstützt. Wir bedanken uns auch für die Unterstützung durch den von MCIN/AEI/ 10.13039/501100011033 finanzierten Zuschuss CEX2018-000806-S und die Unterstützung der Generalitat de Catalunya durch das CERCA-Programm. Diese Forschung ist Teil des ISGlobal-Programms zu den molekularen Mechanismen von Malaria, das teilweise von der Fundación Ramón Areces unterstützt wird. Diese Veröffentlichung verwendet Daten aus dem MalariaGEN SpotMalaria-Projekt, wie in „Jacob CG et al.; Genetische Überwachung in der Groß-Mekong-Subregion und Südasien zur Unterstützung der Malariakontrolle und -eliminierung; eLife 2021;10:e62997 https://doi.org/10.7554/eLife.62997. Das SpotMalaria-Projekt wird vom MalariaGEN Resource Center mit Mitteln von Wellcome (206194, 090770) koordiniert. Die Autoren möchten den Mitarbeitern der Probenverwaltungs-, Genotypisierungs-, Sequenzierungs- und Informatikteams des Wellcome Sanger Institute sowie den Mitarbeitern der Labor- und Klinikabteilung von CISM und ISGlobal für ihren Beitrag danken. Daten zur Sequenzierung des gesamten Genoms wurden auch vom Chan Zuckerberg Biohub (CZB) durch BGs Rolle als CZB-Ermittler erstellt, mit sehr hilfreicher Unterstützung von Norma Neff und dem Rest des CZB-Genomikteams. Die Ergebnisse und Schlussfolgerungen in diesem Bericht stammen von den Autoren und stellen nicht unbedingt den offiziellen Kodon der US-amerikanischen Zentren für die Kontrolle und Prävention von Krankheiten oder der US-amerikanischen Agentur für internationale Entwicklung dar. Die Geldgeber hatten keinen Einfluss auf das Studiendesign, die Datenerfassung, die Datenanalyse, die Dateninterpretation oder das Verfassen dieses Manuskripts. Der korrespondierende Autor hatte vollen Zugriff auf alle Daten der Studie und war letztendlich für die Entscheidung über die Einreichung zur Veröffentlichung verantwortlich.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Clemente da Silva, Simone Boene.

Manhiça Health Research Center (CISM), Maputo, Mosambik

Clement da Silva, Simone Boene, Arlindo Chidimatembue, Gloria Matambisso, Abel Nhama, Eusebio Macete, Lydia Nhamussua, Beatrice Galatas, Peter L. Alonso, Peter Aide, Francisco Saute und Alfredo Mayor

ISGlobal, Hospital Clínic – Universität Barcelona, ​​​​Barcelona, ​​​​Spanien

Debayan Datta, Eduard Rovira-Vallbona, Pau Cisteró, Arnau Pujol, Beatriz Galatas, Caterina Guinovart und Alfredo Mayor

EPPIcenter-Forschungsprogramm, Abteilung für HIV, ID und globale Medizin, Department of Medicine, University of California, San Francisco, CA, USA

Andrew Aranda-Diaz, Zephaniah Tessema und Bryan Greenhouse

Chan Zuckerberg Biohub, San Francisco, CA, USA

Andres Aranda-Diaz

Chan Medical School der Universität von Massachusetts, Worcester, MA, USA

Nicholas Hathaway

National Institute of Health (INS), Gesundheitsministerium, Maputo, Mosambik

Abel Nhama, Sonia Enosse und Peter Aide

Weltgesundheitsorganisation, WHO-Landesbüro Maputo, Maputo, Mosambik

Eva De Carvalho

Malaria-Abteilung, Abteilung für parasitäre Krankheiten und Malaria, US-amerikanische Zentren für die Kontrolle und Prävention von Krankheiten, Atlanta, GA, USA

Eric Rogier

Malaria-Initiative des Präsidenten der Vereinigten Staaten, Malaria-Abteilung, Abteilung für parasitäre Krankheiten und Malaria, Zentren für die Kontrolle und Prävention von Krankheiten der Vereinigten Staaten, Atlanta, GA, USA

Mateusz M. Plucinski

Clinton Health Access Initiative, Maputo, Mosambik

James Colborn

Malaria-Initiative des US-Präsidenten, USAID, Washington, DC, USA

Rose Zulliger

Malaria-Initiative des US-Präsidenten, USAID, Maputo, Mosambik

Abuchahama Saifodine

Krankenhausklinik der Universität Barcelona, ​​​​Barcelona, ​​​​Spanien

Pedro L. Alonso

Nationales Malariakontrollprogramm, Gesundheitsministerium, Maputo, Mosambik

Baltazar Candrinho

Spanisches Konsortium für Forschung in Epidemiologie und öffentlicher Gesundheit (CIBERESP), Madrid, Spanien

Alfredo Bürgermeister

Abteilung für Physiologische Wissenschaften, Medizinische Fakultät, Universidade Eduardo Mondlane, Maputo, Mosambik

Alfredo Bürgermeister

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Verfasste den ersten Entwurf des Manuskripts: AM, CdS und SB. Bietete technische Unterstützung für die Laborarbeit und analysierte molekulare Daten: PC, AC, NH, BG, ST und ER. Koordinierte Feldforschungsaktivitäten: AN, BG, GM, LN, und AC führten die bioinformatische Analyse durch: DD und NH konzipierten und gestalteten die Studienprotokolle der ursprünglichen Studien, aus denen die Proben stammten: PA, FS, BC, EM, PLA, SE, CG, BG, EdC, BG, MMP, JC, AP , AS, RZ und AM An der Interpretation der Ergebnisse beteiligt: ​​AP, ER-V., DD, AA-D. und AM Hat Kommentare zum Manuskript abgegeben: AP, AN, ER-V., CG, RZ, BG, SB, BG, MMP, SB, BG, PLA und AA-D. Das endgültige Manuskript überprüft und genehmigt: Alle.

Korrespondenz mit Alfredo Mayor.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Communications Biology dankt Emanuel Heitlinger und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteure: Nishith Gupta, Zhijuan Qiu und George Inglis. Eine Peer-Review-Datei ist verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

da Silva, C., Boene, S., Datta, D. et al. Gezielte Sequenzierung und Sequenzierung des gesamten Genoms zeigen ein Nord-Süd-Gefälle bei den Arzneimittelresistenzmarkern und der genetischen Struktur von P. falciparum in Mosambik. Commun Biol 6, 619 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04997-7

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Eingegangen: 28. Dezember 2022

Angenommen: 30. Mai 2023

Veröffentlicht: 08. Juni 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04997-7

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