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Jul 26, 2023

Strukturelle Basis für die GSDMB-Porenbildung und deren Targeting durch IpaH7.8

Naturband 616, Seiten

Nature Band 616, Seiten 590–597 (2023)Diesen Artikel zitieren

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Gasdermine (GSDMs) sind porenbildende Proteine, die durch Pyroptose eine entscheidende Rolle bei der Abwehr des Wirts spielen1,2. Unter den GSDMs ist GSDMB aufgrund seines ausgeprägten Lipidbindungsprofils und des fehlenden Konsenses über sein pyroptotisches Potenzial einzigartig 3,4,5,6,7. Kürzlich wurde gezeigt, dass GSDMB durch seine porenbildende Aktivität eine direkte bakterizide Wirkung zeigt4. Shigella, ein intrazelluläres, an den Menschen angepasstes Enteropathogen, entgeht dieser GSDMB-vermittelten Wirtsabwehr durch die Sekretion von IpaH7.8, einem Virulenzeffektor, der den Ubiquitinierungs-abhängigen proteasomalen Abbau von GSDMB4 auslöst. Hier berichten wir über die kryogenen Elektronenmikroskopstrukturen von menschlichem GSDMB im Komplex mit Shigella IpaH7.8 und der GSDMB-Pore. Die Struktur des GSDMB-IpaH7.8-Komplexes identifiziert ein Motiv aus drei negativ geladenen Resten in GSDMB als die von IpaH7.8 erkannte strukturelle Determinante. Beim Menschen, aber nicht bei der Maus, enthält GSDMD dieses konservierte Motiv, was die Speziesspezifität von IpaH7.8 erklärt. Die GSDMB-Porenstruktur zeigt den alternativen, durch Spleiß regulierten Interdomänenlinker in GSDMB als Regulator der GSDMB-Porenbildung. GSDMB-Isoformen mit einem kanonischen Interdomänenlinker weisen eine normale pyroptotische Aktivität auf, während andere Isoformen eine abgeschwächte oder keine pyroptotische Aktivität aufweisen. Insgesamt wirft diese Arbeit Licht auf die molekularen Mechanismen der Erkennung und des Targetings von GSDMs durch Shigella IpaH7.8 und zeigt eine strukturelle Determinante in GSDMB, die für seine pyroptotische Aktivität entscheidend ist.

Gasdermin (GSDM)-Proteine ​​bestehen aus einer N-terminalen porenbildenden Domäne (GSDM-N), einer C-terminalen autoinhibitorischen Domäne (GSDM-C) und einem Interdomänenlinker7,8,9,10,11,12,13,14 ,15. Menschliches GSDMB verfügt über mehrere Spleißisoformen (Isoformen 1–6, Q8TAX9; UniProt), die sich in ihren Interdomänenlinkern unterscheiden. Die Isoformen 1, 4 und 6 enthalten „kanonische“ Interdomänenlinker, während die Isoformen 2 und 3 verkürzte Linker enthalten und Isoform 5 nur die C-terminale Domäne umfasst16. Während umstritten bleibt, ob GSDMB Pyroptose induziert, zeigte eine aktuelle Studie, dass GSDMB bevorzugt die Bakterienmembran angreift und das mikrobielle Wachstum und die Ausbreitung direkt während der Infektion einschränkt4,13. Dieser Prozess wird jedoch durch Shigella – ein hochinfektiöses gramnegatives Bakterium, das akute Gastroenteritis verursacht17 – durch sein sezerniertes Effektorprotein IpaH7.8 untergraben (Lit. 4). Überraschenderweise bindet IpaH7.8 neben GSDMB auch GSDMD. Allerdings ubiquitiniert IpaH7.8 nur menschliches GSDMD, nicht aber Maus-GSDMD18, was möglicherweise damit zusammenhängt, dass Menschen und nichtmenschliche Primaten die natürlichen Reservoire für Shigella sind, Mäuse hingegen nicht19. Die molekularen Mechanismen, warum GSDMB anders als andere GSDMs bei der Auslösung von Pyroptose funktioniert und wie GSDMB und menschliches GSDMD spezifisch von Shigella IpaH7.8 erkannt werden, sind unbekannt.

Um zu verstehen, wie GSDMB von Shigella IpaH7.8 erkannt wird, haben wir die kryogene Elektronenmikroskopie (Kryo-EM)-Struktur von menschlichem GSDMB (Isoform 1, Q8TAX9-1) im Komplex mit Shigella flexneri IpaH7.8 mit einer Gesamtauflösung von 3,8 Å bestimmt (Erweiterte Daten Abb. 1 und erweiterte Datentabelle 1). Die Struktur zeigt einen 1:1-Komplex mit der Bindung der IpaH7.8-LRR-Domäne an GSDMB-N (Abb. 1a, b). IpaH7.8-LRR organisiert sich in einer leicht gekrümmten Solenoidstruktur, die neun LRR-Motive enthält, die von zwei N-terminalen α-Helices (α1 und α2) und einer C-terminalen α4-Helix abgedeckt werden, zusammen mit einem parallelen β10-Strang, der das β direkt verstärkt -Blatt von LRR (Abb. 1c). Die Gesamtarchitektur von IpaH7.8-LRR ist den zuvor berichteten Strukturen der LRR-Domänen in IpaH1.4 und IpaH3 (Lit. 20, 21) sehr ähnlich (Abb. 1d). Die Dichte der C-terminalen NEL-Domäne von IpaH7.8 ist auf der Karte nicht sichtbar, wahrscheinlich aufgrund ihrer Flexibilität im Komplex, die die Ubiquitinierung mehrerer Lysine in GSDMB4 ermöglicht (Extended Data, Abb. 1c).

a, Domänenschemata von IpaH7.8 und GSDMB. Die Domänengrenzen sind beschriftet. b, Gesamtstruktur des GSDMB-IpaH7.8-Komplexes in zwei Ansichten. Die LRR-Domäne in IpaH7.8 und die GSDMB-N- und -C-terminalen Domänen sind wie in a gefärbt. c, Banddiagramm, das die Struktur der IpaH7.8-LRR-Domäne zeigt. d, Überlagerung von IpaH7.8-LRR (Lachs) auf die LRR-Domänen IpaH1.4 (Gelb; PDB: 7V8H) und IpaH3 (Cyan; PDB: 3CVR). e, Gesamtstruktur von GSDMB (links) und Überlagerung der Strukturen von GSDMB und Maus-GSDMA3 (PDB: 5B5R) (rechts). Der β4-Strang in Maus-GSDMA3 wird in der GSDMB-Struktur nicht beobachtet. Die N- und C-terminalen Domänen von GSDMA3 sind braun bzw. grau gefärbt. f, Nahaufnahme der Schnittstelle zwischen GSDMB-N-terminaler α4-Helix und GSDMB-C. GSDMB-C wird als elektrostatische Potentiale und die GSDMB-N-terminale α4-Helix als Cartoon dargestellt, wobei an der Wechselwirkung beteiligte hydrophobe Reste als Stäbchen dargestellt sind. NT, N-terminale Domäne; CT, C-terminale Domäne.

GSDMB nimmt eine automatisch inhibierte Konformation an, die der von GSDMA3 und GSDMD7,8 sehr ähnlich ist (Abb. 1e). Der vorhergesagte β4-Strang (in Bezug auf die GSDMA3-Struktur) wurde in der Dichte nicht beobachtet, wohingegen die α4-Helix vom GSDMB-N wegragt, um GSDMB-C zu kontaktieren (Abb. 1e). Die lokale Auflösung von GSDMB-C ist relativ geringer als die des GSDMB-N/IpaH7.8-LRR-Kerns, was auf eine Dynamik zwischen den N- und C-terminalen Domänen von GSDMB hinweist (Extended Data Abb. 1c). Trotz seiner geringen Auflösung konnten wir die Hauptkette von GSDMB-C verfolgen, die ein Bündel aus acht Helices annimmt, ähnlich den zuvor bestimmten Kristallstrukturen6 (Abb. 1e und Extended Data Abb. 2a). Es wurde angenommen, dass GSDMB in seiner Volllängenstruktur eine verringerte Autohemmung aufweist, und zwar aufgrund (1) seiner Fähigkeit, Phosphatidylinositolphosphate und -sulfatide ohne Spaltung zu binden, und (2) dem Fehlen einer Subdomäne in GSDMB-C, die für die Wechselwirkungen zwischen Domänen essentiell ist6, 22 (Erweiterte Daten Abb. 2b). In unserer Struktur fängt GSDMB-C die hervorstehende GSDMB-N-α4-Helix durch eine riesige hydrophobe Furche ein, die durch die Helices α9, α10 und α12 und nicht durch die Helices α9 und α11 gebildet wird, die von der Subdomäne in GSDMA3 beigesteuert werden, was zu einer noch größeren Interdomänenschnittstelle führt GSDMB (3.020 Å2 Gesamtschnittstellenfläche in GSDMB gegenüber 2.745 Å2 in GSDMA3) (Abb. 1e,f). Wir spekulieren, dass GSDMB voller Länge einen anderen Mechanismus für die Bindung von Phospholipiden als die Spaltung verwenden könnte.

Im GSDMB-IpaH7.8-Komplex interagieren sechs von neun LRR-Motiven in IpaH7.8-LRR mit GSDMB-N, was zu einer gesamten vergrabenen Oberfläche von etwa 1.826 Å2 zwischen den beiden Proteinen führt, wobei die wichtigsten Interaktionsbereiche in zwei Teile teilbar sind Patches, I und II. LRR7–LRR9 von IpaH7.8 kontaktieren eine kurze Schleife (α1–β1'-Schleife, Reste 15–21), die mehrere negativ geladene Reste in GSDMB-N enthält, um den ersten Patch (I) zu bilden, während IpaH7.8-LRR4–6 interagieren wobei der β3-Strang in der ersten Erweiterungsdomäne (ED1)9,23 in GSDMB den zweiten Patch (II) bildet (Abb. 2a).

a, Die beiden Schnittstellen zwischen GSDMB und IpaH7.8 sind durch gestrichelte Kästchen hervorgehoben. b, Detaillierte Interaktionen in Schnittstellen-Patch I. An dieser Schnittstelle teilnehmende Reste werden als Ball und Stöcke angezeigt; Wasserstoffbrückenbindungen werden als graue gepunktete Linien dargestellt. c: Coomassie-Blau-gefärbte SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) von In-vitro-Ubiquitinierungsreaktionen unter Verwendung von GSDMB (WT und Mutanten) und IpaH7.8. Ergebnisse repräsentativ für drei unabhängige Experimente. d, Detaillierte Interaktionen im Interface-Patch II. An dieser Schnittstelle beteiligte Reste werden als Kugel und Stöcke angezeigt; Wasserstoffbrückenbindungen werden als graue gepunktete Linien dargestellt. e, Coomassie-Blau-gefärbte SDS-PAGE der In-vitro-Ubiquitinierung von GSDMB durch IpaH7.8 (WT oder Mutanten). Ergebnisse repräsentativ für drei unabhängige Experimente. f, Immunoblots der GSDMB-Ubiquitinierung in HEK293T-Zellen, kotransfiziert mit FLAG-markiertem GSDMB und HA-IpaH7.8 (WT oder Mutanten). WCL, Ganzzelllysate. Ergebnisse repräsentativ für drei unabhängige Experimente. g, Coomassie-Blau-gefärbte SDS-PAGE der In-vitro-Ubiquitinierung von GSDMB oder menschlichem GSDMD (WT und Mutanten) durch IpaH7.8. Ergebnisse repräsentativ für drei unabhängige Experimente. h, Coomassie-Blau-gefärbte SDS-PAGE der In-vitro-Ubiquitinierung von Maus-GSDMD (WT und Mutanten) durch IpaH7.8. D17HG und D17AG ersetzen die nicht konservierte Sequenz (S17GSR20) in Maus-GSDMD durch entsprechende humane GSDMD- bzw. GSDMB-Sequenzen. Die Aminosäuresequenzausrichtung des α1–β1'-Motivs (unterstrichen) zwischen GSDMB und GSDMD von Mensch und Maus ist oben auf der SDS-PAGE dargestellt. Die ausgetauschten Sequenzen zwischen drei GSDMs werden durch das rote Kästchen hervorgehoben. Ergebnisse repräsentativ für drei unabhängige Experimente. i,j, Coomassie-Blau-gefärbte SDS-PAGE von In-vitro-Ubiquitinierungsreaktionen mit IpaH7.8 und GSDMB (WT und Mutanten). Der β3-Strang in GSDMB wurde entweder wie in i angegeben mutiert oder durch die entsprechenden humanen (hβ3) und Maus-GSDMD-Sequenzen (mβ3) in j ausgetauscht. Die Kontrolle in j zeigte die Ubiquitinierung von WT-GSDMB mit der Mutante IpaH7.8C357 an. Ergebnisse repräsentativ für drei unabhängige Experimente.

Interface Patch I wird hauptsächlich durch polare Wechselwirkungen vermittelt. Insbesondere bilden die Seitenketten von Q185 und R186 von LRR7, Y207 und H209 von LRR8 sowie R228, N230 und S232 von LRR9 in IpaH7.8 zehn Wasserstoffbrückenbindungen mit E15, D17, A18 und D21 in GSDMB. Unterdessen bilden die positiv geladenen Seitenketten von R186 und R228 in IpaH7.8 zusätzliche Salzbrücken mit den negativ geladenen Seitenketten von E15 bzw. D21 in GSDMB (Abb. 2b). Interessanterweise fügen sich die Seitenketten von E15 und D17 in GSDMB zusammen mit den umgebenden Resten in IpaH7.8 in zwei kleine Grundtaschen ein, die von R186 und H209 gebildet werden (Extended Data Abb. 3a). Die beiden Taschen sind etwa 10 Å voneinander entfernt, was auf einen möglichen Mechanismus hindeutet, bei dem IpaH7.8 ein spezifisches Motiv erkennt, das zwei Säurereste in genau diesem Abstand enthält. Tatsächlich reduzierten einzelne Mutationen von E15 oder D17 in GSDMB in einen umgekehrt geladenen oder ungeladenen Rest die Ubiquitinierung von GSDMB durch IpaH7.8 in vitro signifikant oder teilweise (Abb. 2c).

Interaktionspatch II wird durch Wasserstoffbrückenbindungen sowie hydrophobe und Van-der-Waals-Wechselwirkungen vermittelt. Die Seitenkette von R125 aus IpaH7.8-LRR4 bildet zwei Wasserstoffbrücken mit der Rückgrat-Carbonylgruppe von E83 und dem Carboxylatsauerstoff OE1 von Q85 in GSDMB. Parallel dazu bildet die Seitenkette von Y165 aus LRR6 zwei Wasserstoffbrückenbindungen mit der Rückgrat-Aminogruppe von L87 und der Rückgrat-Carbonylgruppe von Q85 in GSDMB, und Y166 aus LRR6 bildet eine Wasserstoffbrücke mit der Rückgrat-Carbonylgruppe von L87 in GSDMB. Darüber hinaus kontaktieren die Reste F143, E145 und N146 in LRR5 sowie F161 und H163 in LRR6 von IpaH7.8 den GSDMB-β3-Strang durch umfangreiche hydrophobe und Van-der-Waals-Wechselwirkungen (Abb. 2d).

Strukturbasiertes Sequenz-Alignment zeigt, dass Schlüsselreste in beiden Patches in IpaH7.8 in den äquivalenten Positionen in anderen Proteinen der IpaH-Familie unterschiedlich sind (Extended Data Abb. 3b), was IpaH7.8 zum einzigartigen Mitglied in der IpaH-Familie macht, das speziell auf GSDMB4 abzielt ,18. Mutationen von Schlüsselresten in IpaH7.8, wie R186E, H209G, R228D und R186E/R228D im Schnittstellen-Patch I und F143S, F161G/I181G, Y165A/Y166A und Y165E/Y166E im Schnittstellen-Patch II, beseitigen alle das weitgehend oder vollständig Fähigkeit von IpaH7.8, GSDMB zu ubiquitinieren (Abb. 2e). Mutationen von R186E/R228D und Y165E/Y166E schwächen auch die IpaH7.8-vermittelte Ubiquitinierung und den Abbau von GSDMB in Zellen erheblich ab (Abb. 2f, Extended Data Abb. 3c und ergänzende Abb. 1 und 2).

Es wurde zuvor gezeigt, dass Shigella IpaH7.8 sowohl menschliches als auch Maus-GSDMD bindet; Es ubiquitiniert jedoch nur menschliches GSDMD18. Mithilfe der isothermen Titrationskalorimetrie (ITC) haben wir die Wechselwirkungen zwischen IpaH7.8 und GSDMB/D charakterisiert. IpaH7.8 zeigte eine 46-fach geringere Affinität für menschliches GSDMD (mit einer Dissoziationskonstante (Kd) von 20,4 ± 1,8 μM) als für GSDMB (Kd = 0,44 ± 0,03 μM) (Extended Data Abb. 4a,b). Überraschenderweise wurde keine Interaktion zwischen IpaH7.8 und Maus-GSDMD festgestellt (Extended Data Abb. 4c). In Übereinstimmung mit ihren Affinitäten zeigte die analytische Gelfiltrationschromatographie, dass IpaH7.8 effizient mit GSDMB wanderte und teilweise mit menschlichem GSDMD wanderte, wohingegen es kaum mit Maus-GSDMD wanderte (Extended Data Abb. 4d – f). Wir kommen daher zu dem Schluss, dass Shigella IpaH7.8 menschliches GSDMD bindet, nicht jedoch Maus-GSDMD.

Der Ersatz eines Fragments in der Nähe des N-Terminus (Reste 16–21) durch die menschliche Sequenz rettete erfolgreich den IpaH7.8-vermittelten Abbau von Maus-GSDMD in Zellen18. In unserer komplexen Struktur entspricht dieses Fragment der α1–β1'-Schleife in GSDMB, in der ein Motiv aus drei negativ geladenen Resten (α1–β1'-Motiv) intensiv mit IpaH7.8 interagiert (Abb. 2b). Strukturbasiertes Sequenz-Alignment zeigte, dass dieses Motiv in menschlichem GSDMD, jedoch nicht in Maus-GSDMD konserviert ist (E15MD17AGGD21 in GSDMB, E15LD17HGGD21 in menschlichem GSDMD und E15VS17GSR20GD22 in Maus-GSDMD) (Extended Data Abb. 2b). Maus-GSDMD enthält das konservierte E15, aber der zweite saure Rest ist durch ein Serin (mS17) ersetzt. Maus-GSDMD enthält auch den konservierten dritten sauren Rest (mD22), weist jedoch eine einzigartige Arginin-Insertion an Position 20 (mR20) auf (Extended Data Abb. 2b). Die Substitution von D17 durch ein Serin kann seine Wechselwirkung mit Y207 und N230 in IpaH7.8 stören, während die mR20-Insertion wahrscheinlich die folgende Asparaginsäure (mD22) von der Wechselwirkung mit R228 in IpaH7.8 wegdrängt (Abb. 2b) und so die Wechselwirkungen zwischen ihnen blockiert Maus GSDMD und IpaH7.8. Dementsprechend blockierte eine einzelne Mutation mit einer Arginin-Insertion an Position 20 (R20Ins) und eine doppelte Mutation von D17S/R20Ins in GSDMB und menschlichem GSDMD ihre Interaktion mit IpaH7.8 und beeinträchtigte anschließend die IpaH7.8-vermittelte Ubiquitinierung (Abb. 2g und erweitert). Daten Abb. 4g,h). Andererseits rettete der Ersatz des nicht konservierten α1–β1'-Motivs in Maus-GSDMD durch die entsprechenden GSDMB- oder menschlichen GSDMD-Reste die Ubiquitinierung von Maus-GSDMD durch IpaH7.8 (Abb. 2h).

Trotz des ähnlichen Strukturmerkmals ist die Aminosäuresequenz von β3-Strängen in GSDMs sehr unterschiedlich (Extended Data Abb. 4i). Wir haben uns gefragt, ob der β3-Strang in GSDMs als weiterer struktureller Determinant für die Erkennung durch IpaH7.8 fungiert. Der β3-Strang in GSDMB interagiert jedoch hauptsächlich über sein Rückgrat mit IpaH7.8, was auf einen sequenzunabhängigen Interaktionsmodus hinweist. In Übereinstimmung mit unserer Hypothese hatten Mutationen im β3-Strang von GSMDB keinen Einfluss auf die Ubiquitinierung (Abb. 2i). Darüber hinaus hatte der Austausch von β3-Strängen zwischen GSDMB, menschlichem GSDMD und einem Maus-GSDMD-Mutanten mit einer Rettungsmutation (D17HG) keinen Einfluss auf deren Ubiquitinierung (Abb. 2j und erweiterte Daten Abb. 4j). Wir kommen daher zu dem Schluss, dass das Motiv mit drei negativ geladenen Resten in der α1-β1'-Schleife die strukturelle Determinante in GSDMs ist.

Da der β3-Strang ein wesentliches Element der GSDM-Porenbildung8,9,23 ist, haben wir anschließend getestet, ob die Bindung von IpaH7.8 an diesen Strang die GSDMB-Porenbildung direkt hemmt. Wie erwartet verursachte mit Granzym A (GZMA) gespaltenes GSDMB ein schnelles Austreten von 6-Carboxyfluorescein (6-FAM)-Farbstoff aus Liposomen, die Cardiolipin (CL)4 enthielten (Abb. 3a), was auf die Bildung von GSDMB-Poren hinweist. Dieses GSDMB-induzierte Austreten von Liposomen wurde in Gegenwart von IpaH7.8 weitgehend gehemmt, wohingegen keine signifikante Hemmung beobachtet wurde, wenn GSDMB mit IpaH7.8Y165E/Y166E oder IpaH7.8R228D/R186E inkubiert wurde, zwei IpaH7.8-Mutanten, die nicht mehr mit IpaH7.8 interagieren GSDMB (Abb. 3a und erweiterte Daten Abb. 5a). IpaH7.8C357A, ein katalytisch inaktiver Mutant, der immer noch GSDMB4,18 bindet, schwächte ebenfalls den GSDMB-induzierten Liposomenaustritt ab (Abb. 3a). Die Konzentrationstitration zeigte außerdem, dass IpaH7.8 die Aktivität von GSDMB dosisabhängig hemmte, mit einer halbmaximalen Hemmkonzentration (IC50) von 1,46 ± 0,11 μM (Abb. 3b und erweiterte Daten Abb. 5b). IpaH7.8 hatte keinen Einfluss auf die Spaltung von GSDMB, hemmte jedoch direkt die Bindung von GSDMB-N an Liposomen (Extended Data Abb. 5c). Interessanterweise hemmte IpaH7.8 das durch Caspase-11-gespaltene menschliche GSDMD verursachte Liposomenleck nicht (Extended Data, Abb. 5d). Die Assoziation von menschlichem GSDMD-N mit Liposomen wurde nur durch sehr hohe Konzentrationen von IpaH7.8 gehemmt (Extended Data Abb. 5e).

a, Die Fähigkeit von GSDMB, bei Inkubation mit IpaH7.8 (WT oder angegebene Mutanten) das Austreten von CL-haltigen Liposomen (CL-Liposomen) zu induzieren. b, Dosis-Wirkungs-Kurve von IpaH7.8 bei der Hemmung der porenbildenden Aktivität von GSDMB in einem Liposomen-Leckage-Assay. Die anfängliche Steigung des Fluoreszenzanstiegs (RU min–1) wurde gegen den Logarithmus der IpaH7.8-Konzentration aufgetragen, um den IC50 von IpaH7.8 zu bestimmen. RU, relative Einheit der Fluoreszenz. a,b, Jeder Punkt stellt den Mittelwert ± Standardabweichung von drei technischen Replikaten dar. c, Hemmung der GSDMB-vermittelten Bakterientötung durch IpaH7.8. WT: Wildtyp; JJ: Y165E/Y166R; RR: R186E/R228D. Fehlerbalken, Mittelwert ± Standardabweichung von drei unabhängigen Experimenten. *P < 0,05, **P < 0,005, ***P < 0,0005. Einwegvarianzanalyse (ANOVA) gefolgt von Tukeys Post-hoc-Test im Vergleich zur Pufferkontrolle. d, Liposomen-Sedimentationstest, der die Assoziation von ubiquitiniertem und nicht-ubiquitiniertem GSDMB mit CL-Liposomen zeigt. Überstände und Pellets (Liposomen) wurden mittels SDS-PAGE analysiert, gefärbt mit Coomassie-Blau. FL, volle Länge. e, Wirkung der Ubiquitinierung auf die Hemmung der porenbildenden Aktivitäten von GSDMB bei der Induktion der Fluoreszenzfreisetzung aus CL-Liposomen. Jeder Punkt stellt den Mittelwert ± Standardabweichung von drei technischen Replikaten dar. f, Lysine in der Transmembranregion, Lipidbindungs- und Oligomerisierungsschnittstellen sowohl in GSDMB als auch in menschlichem GSDMD werden gezeigt. g, Coomassie-Blau-gefärbte SDS-PAGE der In-vitro-Ubiquitinierung von GSDMB-Mutanten, die kein Lysin (allKR) oder einzelnes Lysin (wie angegeben) enthalten. Ergebnisse repräsentativ für drei unabhängige Experimente. h, Überwachung der porenbildenden Aktivitäten ubiquitinierter GSDMB-Mutanten aus g unter Verwendung von CL-Liposomen. Fluoreszenzmessungen wurden zum Zeitpunkt von 30 Minuten durchgeführt. Die Ergebnisse stellen den Mittelwert ± Standardabweichung von drei technischen Replikaten dar. i, Überwachung der porenbildenden Aktivität der ubiquitinierten GSDMB3R-Mutante. GSDMB3R: K177/K190/K192 sind in GSDMB zu Argininen mutiert. Jeder Punkt stellt den Mittelwert ± Standardabweichung von drei technischen Replikaten dar.

Da GSDMB durch die Erkennung spezifischer Phospholipide auf der Bakterienmembran eine direkte mikrobiozide Aktivität besitzt, haben wir anschließend untersucht, ob IpaH7.8 die antibakterielle Aktivität von GSDMB direkt hemmt. Wir fanden heraus, dass etwa 50 % der Escherichia coli DH5α abgetötet wurden, wenn sie GZMA-gespaltenem GSDMB ausgesetzt wurden, wohingegen die Lebensfähigkeit der Bakterien durch die Zugabe von Wildtyp (WT) IpaH7.8 deutlich gerettet wurde, nicht jedoch durch die Mutanten IpaH7.8Y165E/Y166E und IpaH7 .8R186E/R228D. GSDMB voller Länge oder IpaH7.8 allein zeigten keinen Einfluss auf das Bakterienwachstum (Abb. 3c). Diese Beobachtungen legen nahe, dass IpaH7.8 ein direkter Inhibitor von GSDMB ist.

Die IpaH7.8-vermittelte Ubiquitinierung selbst reichte nicht aus, um die Assoziation von GSDMD mit Membranen zu verhindern (Extended Data Abb. 5f). Die Hemmung der GSDMD-vermittelten Pyroptose durch IpaH7.8 beruht auf dem anschließenden proteasomalen Abbau . In Übereinstimmung mit diesem Bericht zeigte unser Liposomenleckagetest eine Aktivität von ubiquitiniertem menschlichem GSDMD, die mit der von nicht-ubiquitiniertem vergleichbar ist (Extended Data Abb. 5g). Unerwarteterweise verlor ubiquitiniertes GSDMB jedoch fast vollständig seine Fähigkeit, sich mit Liposomen zu assoziieren, und seine porenbildende Aktivität, um das Austreten von Liposomen zu induzieren (Abb. 3d, e).

Wir fragten uns dann, welche Lysine in GSDMB-N für die durch Ubiquitinierung vermittelte Hemmung der porenbildenden Aktivität verantwortlich sind. GSDMB enthält 31 Lysine, davon 16 in der porenbildenden Domäne, während es in menschlichem GSDMD nur 15 Lysine gibt, von denen 12 in der porenbildenden Domäne liegen. Unter diesen Lysinen ist K14 in GSDMB einzigartig und befindet sich am C-Terminus der Helix α1, einer Region, die an der GSDM-Porenanordnung9,23 beteiligt ist, und K43 befindet sich in der Nähe der Lipid-Bindungsschnittstelle. Die Ubiquitinierung von K14 und K43 kann die Oligomerisierung und Lipidbindung von GSDMB-N beeinflussen. K102, K177, K190 und K192 befinden sich in der Transmembranregion und sind sowohl in GSDMB als auch in GSDMD konserviert; Sie sind jedoch in GSDMB weiter in der Membran vergraben als in GSDMD (Abb. 3f und erweiterte Daten Abb. 6). Die Ubiquitinierung dieser Reste kann die Membraninsertion von GSDMB beeinflussen. Um diese Möglichkeiten experimentell zu untersuchen, haben wir ein GSDMB-Konstrukt erstellt, bei dem alle Lysine zu Argininen mutiert waren (Mutante allR) und Konstrukte, die entweder ein einzelnes Lysin (K14, K102 oder K177) oder zwei Lysine (K190/K192) enthielten. In-vitro-Ubiquitinierungstests zeigten, dass alle diese GSDMB-Konstrukte die Aktivierung der E3-Ligaseaktivität von IpaH7.8 auslösten, was auf die korrekte Faltung dieser Mutanten und ihre Fähigkeit zur Bindung von IpaH7.8 hinweist (Lit. 24) (Abb. 3g, Poly-Ub ). Allerdings wurden nur GSDMBK177 und GSDMBK190/K192 durch IpaH7.8 ubiquitiniert (Abb. 3g, Verschwinden von GSDMB-FL im Vergleich zu Eingaben). Dementsprechend zeigten die ubiquitinierten GSDMBK177- und GSDMBK190/K192-Mutanten deutlich abgeschwächte Aktivitäten bei der Induktion des Liposomenlecks (Abb. 3h). Als nächstes mutierten wir alle drei Lysine (K177, K190 und K192) in WT-GSDMB (Mutante 3R) und testeten die Wirkung auf Ubiquitinierung und porenbildende Aktivität. Die GSDMB3R-Mutante wurde weiterhin durch IpaH7.8 ubiquitiniert, was auf die Existenz anderer Ubiquitinierungsstellen in GSDMB4,18 hinweist (Extended Data Abb. 5h). Ubiquitiniertes GSDMB3R besaß jedoch eine porenbildende Aktivität, die mit nicht-ubiquitiniertem GSDMB3R vergleichbar war (Abb. 3i). Zusammenfassend kommen wir zu dem Schluss, dass die Ubiquitinierung von GSMDB durch IpaH7.8 an K177, K190 und K192 ausreicht, um seine porenbildende Aktivität zu hemmen, ohne dass ein proteasomaler Abbau erforderlich ist.

Trotz seiner direkten bakteriziden Wirkung4 bleibt es unklar, ob GSDMB Pyroptose induziert. Wir haben festgestellt, dass die Interdomänenlinker in fünf menschlichen GSDMB-Isoformen (Isoformen 1–4 und 6) sowohl in der Länge als auch in der Sequenz variieren (Abb. 4a und Extended Data Abb. 6). Der Linker ist nicht an der GSDMB-IpaH7.8-Wechselwirkung beteiligt (Abb. 1e), und alle fünf GSDMB-Isoformen wurden von IpaH7.8 gleichermaßen zur Ubiquitinierung und Hemmung gezielt (Extended Data Abb. 7a, b); Der Linker beeinflusst auch nicht die GZMA-Spaltung (Extended Data Abb. 7c). Vielmehr könnte der Linker eine Rolle bei der Regulierung der porenbildenden Aktivität von GSDMB spielen3. Frühere Studien haben gezeigt, dass die GSDMB-Isoformen 4 und 6, die die kanonische Sequenz im Interdomänenlinker enthalten, sowohl in vitro als auch in Zellen starke membranpermeabilisierende Aktivitäten zeigten 5,7, wohingegen Isoform 2, der die kanonische Sequenz fehlt, keine pyroptotische Aktivität aufweist3. Überraschenderweise induziert Isoform 1, die auch die kanonische Sequenz in ihrem Interdomänenlinker enthält, keinen pyroptotischen Zelltod; Vielmehr zielt es auf Bakterienmembranen ab, um Bakterien abzutöten4. Übereinstimmend stellten wir fest, dass Zellen, die mit der N-terminalen Domäne der Isoformen 4 oder 6, jedoch nicht mit der der Isoformen 1, 2 oder 3, transfiziert waren, im Vergleich zu Zellen, die mit GSDMBs voller Länge transfiziert waren, einen deutlichen pyroptotischen Zelltod aufwiesen (Abb. 4b und). Erweiterte Daten Abb. 7d). Interessanterweise wurde der durch Isoform 4 vermittelte pyroptotische Zelltod bei Koexpression mit Shigella IpaH7.8 signifikant gehemmt. Diese Hemmung war unabhängig von der E3-Ligase-Aktivität von IpaH7.8 (Extended Data Abb. 7e, f), was weiter bestätigt, dass die IpaH7.8-Bindung die porenbildende Aktivität von GSDMB direkt gehemmt hatte. Um die porenbildenden Aktivitäten von GSDMB-Isoformen gegen Plasmamembranen von Säugetieren in vitro weiter zu untersuchen, führten wir einen Liposomenleckagetest mit Liposomen durch, die 10 % Phosphatidylserin (PS) enthielten. Unsere Ergebnisse zeigten, dass die Isoformen 4 und 6 starke permeabilisierende Aktivitäten gegenüber PS-Liposomen zeigten, während die Isoformen 2 und 3 keine membranpermeabilisierende Aktivität zeigten (Abb. 4c). Ähnliche Ergebnisse wurden auch für Liposomen beobachtet, die polare Leberlipidextrakte enthielten (Abb. 4d). Interessanterweise zeigte Isoform 1 im Vergleich zu den Isoformen 4 und 6 nur 20–40 % porenbildende Aktivität (Abb. 4c, d). Die schwache permeabilisierende Aktivität von GSDMB-Isoform 1 ist wahrscheinlich nicht stark genug, um die Membranreparaturbemühungen zellulärer Maschinen, einschließlich ESCRT-III26, zu überwinden und Pyroptose auszulösen, wohingegen sie ausreicht, um Bakterien abzutöten, denen Membranreparaturmechanismen fehlen, obwohl Isoform 1 für Bakterien toxisch ist war etwas schwächer als die der Isoformen 4 und 6 (Extended Data Abb. 7g). Diese Daten deuten darauf hin, dass GSDMB-Isoformen, die sich in ihren Interdomänen-Linkern unterscheiden, unterschiedliche porenbildende Aktivitäten aufweisen.

a, Schema der GSDMB-Isoformen 1–4 und 6. Gezeigt sind Aminosäuresequenzen (aa) von Interdomänenlinkern. Kanonische Sequenzen sind orange gefärbt und unterstrichen, die drei positiv geladenen Reste, die die Lipidbindung vermitteln, sind blau hervorgehoben und die GZMA-Spaltungsstelle ist markiert. Isoform 5 ist nicht dargestellt, da sie nicht die N-terminale porenbildende Domäne enthält. b, Zytotoxizität von GSDMB-Isoformen, gemessen durch Hoechst/Propidiumiodid (PI)-Doppelfärbungstest in transient transfizierten HEK293T-Zellen. Fehlerbalken, Mittelwert ± Standardabweichung von drei unabhängigen Experimenten. Einfaktorielle ANOVA, gefolgt von Tukeys Post-hoc-Test. ****P < 0,00001. c,d, Überwachung der porenbildenden Aktivitäten gereinigter GSDMB-Isoformen unter Verwendung von Liposomen mit 10 % PS (c) und Liposomen, die lebende polare Lipidextrakte umfassen (d). Jeder Punkt stellt den Mittelwert ± Standardabweichung von drei technischen Replikaten dar.

Um die Frage zu beantworten, warum GSDMB-Isoformen unterschiedliche porenbildende Aktivitäten aufweisen, haben wir versucht, die Kryo-EM-Struktur der GSDMB-Pore zu bestimmen. Obwohl die GSDMB-Isoformen 1, 4 und 6 in Größe und Form ähnliche Poren bildeten, zeigten die von Isoform 1 eine geringere Aggregation als die der Isoformen 4 und 6, und es wurde beobachtet, dass die Poren von Isoform 1 gleichmäßig auf Kryo-EM-Gittern verteilt waren (Extended Data Abb . 8a,b). Daher haben wir die GSDMB-Isoform 1 einer Kryo-EM-Analyse unterzogen. Die dreidimensionale (3D) Klassifizierung des gesammelten Kryo-EM-Datensatzes ergab eine Hauptklasse von GSDMB-β-Fass-Poren, eine Klasse von Ringen ohne β-Fass, die Präporen darstellen, und andere Klassen, die GSDMB-Präporen-Poren-Übergangszwischenzustände darstellen9,23 ( Erweiterte Daten Abb. 8c und 9a,b). Es wurde festgestellt, dass die GSDMB-Pore 24–26-fach symmetrisch ist (Abb. 5a). Die 3D-Verfeinerung der 24-fach symmetrischen Pore führte zu einer endgültigen Karte mit einer Gesamtauflösung von 4,96 Å, während die Fokusverfeinerung die lokale Auflösung der kugelförmigen Domäne auf 4,48 Å verbesserte (Erweiterte Daten Abb. 8c, d und Erweiterte Datentabelle 1), was uns dies ermöglichte Erstellen Sie ein Atommodell der GSDMB-Pore unter Verwendung der Struktur von GSDMB im Komplex von GSDMB/IpaH7.8 als Ausgangsmodell.

a, Banddiagramm der Porenstruktur der GSDMB-Isoform 1 mit 24 Untereinheiten, angepasst an ihre Kryo-EM-Dichtekarte. TM, Transmembran. b, Struktur einer GSDMB-Untereinheit in ihrer Porenkonformation, angepasst an die Kryo-EM-Karte. c: Es sind drei Lipidbindungsstellen (BS1–3) in GSDMB dargestellt, die sich jeweils an α1 und den Schleifen β1–β2 und β7–β8 befinden. An der Lipidbindung beteiligte Rückstände werden markiert. d–f, Diagramm, das zeigt, wie menschliches GSDMD (d), GSDMB-Isoform 1 (e) und GSDMB-Isoformen 4 und 6 (f) auf Membranen verankern. Interdomänen-Linker in GSDMs werden durch die angezeigten Farben hervorgehoben. Positiv geladene Reste, die im Interdomänenlinker markiert sind, bilden eine zusätzliche Lipidbindungsstelle (BS4). GSDMB-Isoform 1 bewahrt aufgrund einer Insertion von vier Aminosäuren nur einen positiv geladenen Rest im Interdomänenlinker. g, Überwachung der porenbildenden Aktivitäten von GSDMB-Isoform 4 (links) und menschlichem GSDMD (hGSDMD, rechts) durch Liposomen-Leckage-Assay. BS4: Dreifache Mutationen der drei Grundreste (R225/K227/K229 in GSDMB-Isoform 4 und K235/K236/R238 in hGSDMD) zu Glutaminsäuren. GSDMB-Isoform 4 und hGSDMD wurden durch GZMA bzw. aktive Caspase-11 gespalten. Jeder Punkt stellt den Mittelwert ± Standardabweichung von drei technischen Replikaten dar. h, Wirkung von BS4 von GSDMB-Isoform 4 und hGSDMD auf die Induktion des pyroptotischen Zelltods in HEK293T-Zellen, überwacht durch Hoechst/PI-Doppelfärbungsassay. NT, N-terminale Domäne; NTBS4, N-terminale Domäne, die die BS4-Mutation beherbergt. Fehlerbalken, Mittelwert ± Standardabweichung von drei unabhängigen Experimenten. Einfaktorielle ANOVA, gefolgt von Tukeys Post-hoc-Test, **P < 0,005, ****P < 0,00005.

Die 24-fache GSDMB-Pore hat einen geschätzten Innendurchmesser von 150 Å, einen Außendurchmesser von 250 Å und eine Höhe von 60 Å (Abb. 5a), was der 27-fachen GSDMA3-Pore sehr ähnlich ist, aber viel kleiner als die 31-fache GSDMD-Pore9 ,23. Ähnlich wie bei GSDMA3 und GSDMD umfasst jede GSDMB-Porenuntereinheit eine globuläre Domäne („Handfläche“) und zwei eingefügte β-Haarnadeln („Finger“), die aus Resten in den Erweiterungsdomänen 1 und 2 (ED1 bzw. ED2) in generiert werden Automatisch inhibiertes GSDMB in voller Länge (Abb. 5b und erweiterte Daten Abb. 9c). Die Analyse der GSDMB-Pore zeigte konservierte Oligomerisierungsschnittstellen, die zuvor sowohl in GSDMA3 als auch in GSDMD9,23 beobachtet wurden. Die Oligomerisierung der GSDMB-Poren wird sowohl durch die inserierten β-Stränge in der Transmembranregion als auch durch die zytosolischen globulären Domänen vermittelt (Extended Data, Abb. 9d). Die Wechselwirkung in der Transmembranregion wird durch Reste verursacht, die entlang der benachbarten β3- und β8-Stränge zwischen den Untereinheiten verlaufen (Extended Data Abb. 9d). Die Interaktion in den angrenzenden globulären Domänen enthält hauptsächlich Reste der Helix α3 einer Untereinheit, die mit der Region um α2 und β11 ihrer benachbarten Untereinheit interagieren (Extended Data Abb. 9d); und die α1-Helix einer Untereinheit grenzt end-on an die α1-Helix der nächsten Untereinheit durch Wasserstoffbrückenbindungen und hydrophobe Wechselwirkungen (Extended Data Abb. 9d). Diese konservierten Wechselwirkungen lassen trotz ihrer Variabilität in der Zusammensetzungsstöchiometrie auf einen einheitlichen Oligomerisierungsmechanismus in der GSDM-Familie schließen.

Frühere Studien haben die N-terminale α1-Helix („Daumen“, Bindungsstelle 1 (BS1)), die β1–β2-Schleife mit einer hydrophoben Spitze, flankiert von positiv geladenen Resten („Handgelenk“, Bindungsstelle 2 (BS2)), identifiziert die globuläre GSDM-Domäne und eine positiv geladene Lipidbindungsstelle (Bindungsstelle 3 (BS3)), die auf der membraninserierten β7–β8-Haarnadel vorhanden sind, als Strukturelemente für die Lipidbindung8,9,23. Wie erwartet sind alle drei Bindungsstellen in GSDMB konserviert (Abb. 5c). BS1 und BS2 enthalten basische Reste von R10 und K14 in der α1-Helix und K43, R44 und R50 in der β1–β2-Schleife, die mit den sauren Lipidkopfgruppen interagieren, sowie hydrophobe Reste von F46 und F47 in der hydrophoben Spitze der β1–β2-Schleife, die inseriert in die Lipiddoppelschicht als Membrananker, wohingegen BS3 durch basische Reste von R174 und R195 in β7 und β8 vermittelt wird (Abb. 5c).

Anschließend haben wir den Interdomain-Linker untersucht. In der menschlichen GSDMD-Pore ist die Dichte des gesamten Interdomänenlinkers (V229–Q241) sichtbar (Extended Data Abb. 9e). Die ersten paar Reste des Interdomänenlinkers in GSDMD (Region 1: V229–F232) sind für die Porenoligomerisierung8 erforderlich (Extended Data Abb. 6 und 9e). Die Mutation der entsprechenden Region in den GSDMB-Isoformen 1 und 4 („AGLD“ in Isoform 1 bzw. „NIHF“ in Isoform 4 zu „GGGG“) beeinträchtigte ihre porenbildenden Aktivitäten deutlich (Extended Data Abb. 9g, h), was darauf hinweist eine ähnliche Rolle der Region 1 in GSDMB. Die folgende Sequenz (Region 2: P233–Q241 in menschlichem GSDMD) im Interdomänenlinker wurde bisher nicht als an der Porenbildung beteiligtes Strukturelement angesehen8,9,23. Überraschenderweise ist auch die Dichte der Region 2 in der GSDMB-Pore sichtbar, unabhängig von der relativ geringeren Auflösung (Extended Data Abb. 9f). Wir schlugen vor, dass Region 2 durch bestimmte Wechselwirkungen in der Pore stabilisiert werden könnte. Region 2 im menschlichen GSDMD enthält drei basische Reste, deren positiv geladene Seitenketten zur Membran zeigen und wahrscheinlich eine zusätzliche Lipidbindungsstelle (BS4) für die Membrananbindung bilden (Abb. 5d). Der kanonische Interdomänenlinker in GSDMB enthält auch grundlegende Reste in Region 2 (Abb. 4a und erweiterte Daten Abb. 6). Allerdings ist nur ein basischer Rest (R229) in der Pore der GSDMB-Isoform 1 strukturell konserviert. Aufgrund einer Insertion aus vier Aminosäuren (222AGLD225) in den Interdomänenlinker wird der Rest an der ersten Position (P1) durch ein negativ geladenes D225 ersetzt (Abb. 5e). Die Substitution durch einen sauren Rest an dieser Position schwächt wahrscheinlich die Membranbindung, indem sie die saure Membranoberfläche abstößt, wodurch die porenbildende Aktivität der GSDMB-Isoform 1 abgeschwächt wird. Die generierten Atommodelle anderer GSDMB-Isoformen decken gesamte Interdomänenlinker ab und basieren auf der Struktur der Isoform 1 und mit Unterstützung der AlphaFold-Vorhersage27 zeigen, dass die Isoformen 4 und 6 im menschlichen GSDMD strukturell konserviert sind und alle drei Grundreste R225, K227 und K229 bewahren (Abb. 5f). Im Gegensatz dazu würde Isoform 3 mit einem verkürzten Interdomänenlinker wahrscheinlich die Oligomerisierungsschnittstelle bewahren, ihr fehlt jedoch der Basiscluster für die Lipidbindung, und Isoform 2 fehlt der gesamte Interdomänenlinker für Oligomerisierung und Lipidbindung. Eine kürzlich durchgeführte Studie, die zeigt, dass GSDMB-Isoformen ohne Exon 6, das die kanonische Sequenz im Interdomänen-Linker kodiert, keine Pyroptose auslösten, unterstützt unser Modell nachdrücklich3.

Die dreifache Mutation von R225E/K227E/K229E im Interdomänenlinker der GSDMB-Isoform 4 beeinträchtigte die Aktivität erheblich, in vitro ein Austreten von Liposomen zu induzieren (Abb. 5g) und den pyroptotischen Zelltod zu vermitteln (Abb. 5h und erweiterte Daten Abb. 9i). Dies bestätigt die entscheidende Rolle von BS4 bei der Vermittlung der GSDMB-Porenbildung. Ähnliche Ergebnisse wurden auch beobachtet, als wir die entsprechenden Reste in menschlichem GSDMD mutierten (Abb. 5g, h und erweiterte Daten Abb. 9j). Zusammenfassend kommen wir zu dem Schluss, dass der Interdomänenlinker das Schlüsselstrukturelement ist, das die pyroptotische Aktivität von GSDMB-Isoformen reguliert, indem er die Porenoligomerisierung vermittelt und eine zusätzliche Lipidbindungsstelle bereitstellt.

Unsere Kryo-EM-Strukturen des GSDMB-IpaH7.8-Komplexes und der GSDMB-Pore zeigen die strukturellen Mechanismen, die der GSDMB-Erkennung durch den bakteriellen Effektor bzw. der pyroptotischen Aktivität von GSDMB zugrunde liegen.

Die Struktur des GSDMB-IpaH7.8-Komplexes identifiziert ein Motiv aus drei negativ geladenen Resten in der N-terminalen α1–β1'-Schleife in GSDMB und menschlichem GSDMD als die strukturelle Determinante, die spezifisch von Shigella IpaH7.8 erkannt wird. IpaH7.8 bindet kein Maus-GSDMD, bei dem das α1–β1'-Motiv nicht konserviert ist, was dazu führt, dass Shigella nicht in der Lage ist, eine Infektion in der Maus effizient zu etablieren. Zuvor wurde berichtet, dass IpaH7.8 Maus-GSDMD mit einer noch stärkeren Affinität bindet als menschliches GSDMD18, was nicht mit unseren Ergebnissen übereinstimmt. Diese Diskrepanz ist auf die unterschiedlichen verwendeten Methoden zurückzuführen. Die in dieser früheren Studie verwendete mikroskalige Thermophoresemethode erfordert die Markierung des Proteins mit hydrophoben Fluoreszenzfarbstoffen, was das Proteinverhalten verändern und zu verwirrenden Ergebnissen führen kann28,29. Alternativ misst die hier verwendete ITC-Methode zuverlässig die Bindungsaffinität von Proteinen in ihrem nativen Zustand, ohne dass eine Markierung erforderlich ist30. Dies wird auch durch unsere Mutageneseexperimente und einen aktuellen Studienbericht31 gestützt.

Unsere Studie zeigt eine hocheffiziente Hemmung von GSDMB durch IpaH7.8: Die Bindung von IpaH7.8 an GSDMB verhinderte direkt dessen Assoziation mit der Membran. Darüber hinaus hemmt die anschließende Ubiquitinierung von GSDMB durch IpaH7.8, wenn Shigella das Ubiquitinierungssystem des Wirts übernimmt, die GSDMB-Aktivität weiter. Diese Hemmung wird durch die Ubiquitinierung von drei Lysinen in der zweiten Transmembran-Haarnadel von GSDMB vermittelt. Ubiquitinierung beeinflusst wahrscheinlich die Membraninsertion von GSDMB und hemmt so dessen porenbildende Aktivität. Diese vielschichtige Hemmung von GSDMB durch IpaH7.8 bietet Shigella eine sehr effiziente Möglichkeit, dem Angriff durch zytotoxische Lymphozyten und natürliche Killerzellen während der Infektion zu entkommen5 und fördert so das Überleben der Bakterien in der Replikationsnische des Wirts.

Die Kryo-EM-Struktur der GSDMB-Pore veranschaulicht einen einzigartigen interdomänenlinkerregulierten Mechanismus der Porenoligomerisierung und Lipidbindung. GSDMB wird weithin in verschiedenen Zelltypen und Geweben exprimiert5,32,33, wo seine Isoformen mit unterschiedlichen Interdomänenlinkern unterschiedlich reguliert werden können. Solche Unterschiede in der Expression und Aktivität von GSDMB-Isoformen stellen wahrscheinlich eine Wirtsstrategie zur Feinabstimmung zelltypspezifischer Ergebnisse der GSDMB-Aktivierung dar. Beispielsweise dominieren pyroptotische GSDMB-Isoformen in Epithelzellen und sind für die Eliminierung der Replikationsnische intrazellulärer Krankheitserreger durch Induktion von Pyroptose in infizierten Zellen verantwortlich, wohingegen nicht-pyroptotische Isoform 1 in Makrophagen oder dendritischen Zellen dominant sein kann, wo sie gezielt angreift und tötet zytosolische Bakterien – anstatt Pyroptose auszulösen – und stellen so das Überleben dieser Antigen-präsentierenden Zellen für die T-Zell-Aktivierung sicher. Derzeit sind die zellspezifische Verteilung, Häufigkeit und Funktion jeder GSDMB-Isoform nicht gut verstanden. Die physiologische Relevanz von GSMDB-Isoformen für die antibakterielle Immunität bedarf weiterer Untersuchungen.

Sowohl GSDMB als auch GSDMD sind im Allgemeinen wichtig im Hinblick auf die angeborene Immunität gegen bakterielle Krankheitserreger. Allerdings minimiert ein Krankheitserreger wie Shigella, der GSDMB und GSDMD beim Menschen stört, deren Beitrag zur Wirtsabwehr, was erklärt, warum Menschen anfällig für Shigella sind, während Mäuse, denen GSDMB fehlt und deren GSDMD nicht empfindlich gegenüber IpaH7.8 ist, Resistenz aufweisen4,18. Es ist erwähnenswert, dass Menschen mit Shigellose in der Regel innerhalb von 5 bis 7 Tagen genesen, ohne dass sie Antibiotika benötigen34, was darauf hindeutet, dass GSDMB und GSDMD, obwohl sie von IpaH7.8 bekämpft werden, immer noch eine Rolle dabei spielen könnten, Shigellen für den Menschen ansteckend zu machen.

Zusätzlich zu bakteriellen Infektionen wird GSDMB mit verschiedenen Krebsarten in Verbindung gebracht. Eine aktuelle Studie zeigte, dass die Expression der nicht-pyroptotischen Isoform 2 bei Brustkrebspatientinnen höher war als die anderer Isoformen3. Eine Hochregulierung der Isoformen 2 und 3 kann die Tumorentstehung und Metastasierung fördern und zu einem schlechten Gesamtüberleben des Patienten führen, wohingegen eine hohe Expression der pyroptotischen Isoform 4 den gegenteiligen Effekt hat3. Angesichts dieses möglichen Zusammenhangs zwischen GSDMB-Isoformen und dem Überleben von Krebs sind weitere Studien erforderlich, um zu untersuchen, ob Krebszellen die unterschiedliche Expression von GSDMB-Isoformen nutzen, um dem Angriff zytotoxischer Lymphozyten zu widerstehen.

Die kodierenden Sequenzen von GSDMs voller Länge wurden nach dem N-terminalen His6-SUMO-Tag in einen pET28-His-SUMO-Vektor kloniert. In Bezug auf das GSDMB-Konstrukt, das für die Kryo-EM-Strukturbestimmung verwendet wurde, wurde nach dem Rest K239 eine humane Rhinovirus-3C-Protease (3C)-Stelle (LEVLFQ/GP) eingefügt. Die kodierende Sequenz von S. flexneri IpaH7.8 wurde in einen pET26b-Vektor mit einem C-terminalen 6XHis-Tag und in einen pET22b-Vektor ohne Affinitäts-Tag zur Koexpression mit GSDMB kloniert. Caspase-11 (96–373) wurde in einen pET22b-Vektor kloniert, um die aktive Form des p20-p10-Komplexes zu reinigen. Für die zellulären Experimente wurden GSDMs (volle Länge) und GSDM-N in einen pcDNA3.1-Vektor kloniert, in dem ein FLAG-Tag am C-Terminus fusioniert war, während IpaH7.8 in einen pCMV-HA-Vektor eingefügt wurde, was zu a führte Fusionsprotein mit einem N-terminalen HA-Tag. Alle Mutationen in dieser Studie wurden entweder mit dem QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene) oder dem Gibson Assembly Master Mix (New England BioLabs) eingeführt und alle Plasmide wurden durch Sequenzierung verifiziert.

Um den GSDMB-IpaH7.8-Komplex zu erhalten, wurden E. coli BL21 (DE3)-Zellen, die die Expressionsplasmide von pET28-His-SUMO-GSDMB und pET22b-IpaH7.8 enthielten, in Lysogenie-Brühe-Medium, ergänzt mit 50 µg ml–1 Kanamycin, gezüchtet und 100 µg ml–1 Ampicillin bei 37 °C. Die Proteinexpression wurde durch die Zugabe von 0,5 mM Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranosid bei 20 °C für 16 Stunden induziert, als die optische Dichte (OD600) 0,8 erreichte. Die Zellen wurden durch 20-minütige Zentrifugation bei 5.000 g gesammelt. Geerntete Zellen wurden durch Ultraschallbehandlung in einem Puffer, der 25 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 2 mM β-Mercaptoethanol und 25 mM Imidazol enthielt, lysiert. Die Lysate wurden 30 Minuten lang bei 18.000 g und 4 °C zentrifugiert, um unlösliche Fraktionen zu entfernen. Überstände, die rekombinante Proteine ​​enthielten, wurden unter Verwendung von Ni-NTA-Agarose (Qiagen) gemäß den Anweisungen des Herstellers gereinigt. Die Entfernung des His6-SUMO-Tags wurde auf einer Ni-NTA-Säule bei 4 °C über Nacht unter Zugabe des rekombinanten Ulp1 durchgeführt. Nicht markierte Durchflussproteine ​​wurden unter Verwendung einer Hitrap Q HP-Ionenaustauschsäule (Cytiva) und anschließend einer Superdex-Erhöhen-200-(10/300)-Größenausschlusssäule (Cytiva) in einem Puffer mit 25 mM HEPES, pH 7,5 und 150 mM, weiter gereinigt NaCl. Alle gereinigten Proteine ​​wurden durch Coomassie-Blau-Färbung von SDS-PAGE bestätigt.

Ähnliche Protokolle wurden für die Expression und Reinigung aller einzelnen GSDMs, IpaH7.8 und ihrer Mutanten, angewendet, mit der Ausnahme, dass der His6-SUMO-Tag für GSDMs beibehalten wurde, die im In-vitro-Ubiquitinierungstest verwendet wurden. Alle gereinigten Proteine ​​wurden vor der Verwendung auf etwa 5–10 mg ml–1 konzentriert.

Das GZMA-Plasmid pET26b-GZMA war ein freundliches Geschenk von J. Lieberman35. Die Plasmide E1 (pET21d-hUbE1), E2 (pET15-hUbE2D2) und Ubiquitin (pET15-Ub) waren freundliche Geschenke von C. Wolberger, W. Harper bzw. R. Klevit36,37,38. Expression und Reinigung folgten früheren Protokollen.

In-vitro-Ubiquitinierungsreaktionen wurden in Puffer A (25 mM HEPES pH 7,5, 50 mM NaCl, 0,1 mM DTT, 10 mM MgCl2 und 5 mM ATP) durchgeführt. Die Komponenten wurden wie angegeben in Konzentrationen von 0,4 µM E1 (menschliches UbE1), 2 µM E2 (menschliches UbE2D2), 10 µM E3 (IpaH7.8WT- oder IpaH7.8C357A-Mutante), 200 µM Ubiquitin und 10 µM GSDM (WT oder angegebene Mutanten) gemischt ). Die Reaktionen wurden 2 Stunden lang bei 37 °C inkubiert und durch Zugabe von SDS-PAGE-Beladungsfarbstoff gestoppt, gefolgt von 5-minütigem Kochen vor der Elektrophorese. Die Ubiquitinierung wurde durch Coomassie-Blau-Färbung von SDS-PAGE bewertet.

Der Liposomenlecktest wurde nach einem etablierten Protokoll9 durchgeführt. Kurz gesagt, 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin und PS oder CL (Avanti Polar Lipids) wurden im angegebenen Verhältnis in einem Glasröhrchen gemischt. Das Lösungsmittel Chloroform wurde unter einem Stickstoffgasstrom 30 Minuten lang verdampft. Der trockene Lipidfilm wurde dann mit Puffer B (25 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl), ergänzt mit 50 mM 6-FAM (Tokyo Chemical Industry), rehydratisiert. Anschließend wurden mit 6-FAM beladene Liposomen unter Verwendung eines Miniextruders (Avanti Polar Lipids) durch eine 1 μm-Membran (Whatman Nuclepore) extrudiert. Um nicht eingekapseltes 6-FAM zu entfernen, wurden extrudierte Liposomen einer PD-10-Entsalzungssäule (Cytiva) ausgesetzt, die mit Puffer B äquilibriert war. Für den Liposomenlecktest wurden Liposomen mit Proteinen von GSDMB/D und/oder IpaH7.8 mit oder ohne inkubiert aktivierende Enzyme (GZMA für GSDMB und Caspase-11p10/p20 für GSDMD). Die Reaktionen wurden auf einer 384-Well-Platte durchgeführt, wobei die Freisetzung von 6-FAM-Farbstoff durch Fluoreszenz bei 517 nm unter Verwendung eines SpectraMax M5-Plattenlesegeräts (Molecular Devices) mit Anregung bei 495 nm für 60 Minuten in Intervallen von 1 Minute überwacht wurde.

Liposomen wurden wie oben beschrieben hergestellt, mit der Ausnahme, dass kein Fluoreszenzfarbstoff verwendet wurde. Liposomen wurden mit GSDMB/D-Proteinen in/ohne Anwesenheit von IpaH7.8 in verschiedenen Molverhältnissen mit oder ohne aktivierende Enzyme inkubiert. Die Mischungen wurden 30 Minuten lang bei 4 °C inkubiert, bevor sie 30 Minuten lang bei 4 °C bei 20.000 g sedimentierten. Die Überstände wurden sofort in neue Röhrchen überführt und die Pellets wurden zweimal mit Puffer B gewaschen und dann in einem gleichen Puffervolumen resuspendiert. Anschließend wurden die Proteine ​​in den Pellets und im Überstand durch Coomassie-Blau-Färbung mittels SDS-PAGE analysiert.

Die Proteinkonzentrationen von nicht markierten GSDMs und IpaH7.8 wurden dreifach mit einem NanoDrop One Microvolume UV-Vis-Spektrophotometer (Thermo Fisher Scientific) basierend auf ihren Extinktionskoeffizienten gemessen. Messungen der isothermen Titrationskalorimetrie wurden bei 20 °C mit einem VP-ITC-Mikrokalorimeter (MicroCal) durchgeführt. Die Experimente wurden durch Injektion von 250 μl IpaH7.8-Lösung (200 μM) in eine Probenzelle durchgeführt, die 2 ml GSDMB (10 μM) in 25 mM Tris-HCl, pH 8,0, und 150 mM NaCl enthielt. Insgesamt wurden 25 Injektionen im Abstand von 300 s verabreicht. In Bezug auf menschliches GSDMD (hGSDMD) und Maus-GSDMD (mGSDMD) wurden 250 μl IpaH7.8-Lösung (625 μM) in eine Probenzelle titriert, die 2 ml entweder hGSDMD (40 μM) oder mGSDMD (40 μM) enthielt. Alle ITC-Daten wurden mit der vom Hersteller bereitgestellten Origin-Software analysiert und an ein One-Site-Bindungsmodell angepasst.

Die 293T-Zellen wurden von der American Type Culture Collection bezogen und häufig auf ihre morphologischen Merkmale und Funktionalitäten überprüft. Die Zellen wurden in DMEM (Gibco), ergänzt mit 10 % (v/v) fötalem Rinderserum (Gibco) und 2 mM L-Glutamin, bei 37 °C in einem 5 % CO2-Inkubator gezüchtet. Die vorübergehende Transfektion in 293T-Zellen wurde unter Verwendung von Lipofectamine 3000 (Thermo Fisher Scientific) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt.

Zum Nachweis der GSDMB-Ubiquitinierung in Zellen wurde pcDNA-FLAG-GSDMB (Isoform 1) mit pCMV-HA-IpaH7.8 (WT oder angegebene Mutanten) in HEK293T-Zellen in einer 10-cm-Gewebekulturschale cotransfiziert. Acht Stunden nach der Transfektion wurde der Zellkultur eine Endkonzentration von 10 μM Bortezomib (Sigma Aldrich) zugesetzt, um den Proteasom-vermittelten Proteinabbau zu reduzieren. Nach weiteren 8 Stunden wurden die Zellen gesammelt und in 25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,5 % NP-40 und 1 × Proteaseinhibitor-Cocktail (Sigma Aldrich) lysiert. Lysat wurde zu 25 μl Anti-FLAG M2-Magnetkügelchen (Sigma Aldrich, Nr. M8823) gegeben und 3 Stunden lang bei 4 °C unter sanfter Rotation inkubiert. Die Perlen wurden dreimal mit PBS-Puffer gewaschen und dann mit 50 μl PBS-Puffer, der 100 μg ml–1 FLAG-Peptid enthielt (Sigma Aldrich, Nr. F3290), eluiert. Eluierte Proben wurden mit einem gleichen Volumen 2× SDS-Ladepuffer (Bio-Rad) gekocht und dann für das Immunblotting mit einem der folgenden Antikörper verarbeitet: Anti-FLAG (Sigma Aldrich, Nr. F1804, 1:1.000), Anti-Actin ( Cell Signaling Technology, Nr. 3700S, 1:1.000), Anti-HA (Cell Signaling Technology, Nr. 3724S, 1:1.000) oder Anti-Ubiquitin (Thermo Fisher Scientific, Nr. PA3-16717, 1:1.000).

Jeweils eins der Plasmide pcDNA-FLAG-GSDMB und pcDNA-FLAG-GSDMD (250 ng) (WT oder angegebene Mutanten) wurde mit 500 ng des Plasmids pCMV-HA-IpaH7.8 in HEK293T-Zellen cotransfiziert, die in einer Platte mit 12 Vertiefungen ausgesät waren bei 1,5 × 105 Zellen pro Vertiefung. Nach 40 Stunden wurden die Zellen in RIPA-Puffer (Thermo Fisher Scientific) lysiert, zu einem gleichen Volumen von 2 × SDS-Ladepuffer (Bio-Rad) gegeben und für das Immunblotting verarbeitet.

Der Zelltod wurde durch einen Hoechst/PI-Doppelfärbungstest bestimmt: 150 ng des angegebenen pcDNA-FLAG-GSDMB-Konstrukts oder 75 ng des pcDNA-FLAG-GSDMD-Plasmids (FL, NT oder angegebene Mutanten) wurden in HEK293T-Zellen transfiziert, die in a ausgesät wurden 96-Well-Platte mit 2 × 104 Zellen pro Well. Zur IpaH7.8-Hemmung wurde pcDNA-FLAG-GSDMB-NT (Isoform 4) mit 200 ng des pCMV-HA-IpaH7.8-Plasmids (WT oder C357A) cotransfiziert. Transfizierte Zellen wurden dann bis zu 40 Stunden lang kultiviert. Zu Beginn des Tests wurden die Zellen 10 Minuten lang mit 30 μM PI (Sigma Aldrich) und anschließend 15 Minuten lang mit 15 μM Hoechst 33342 (Thermo Fisher Scientific) bei 37 °C im Dunkeln gefärbt. Anschließend wurden die Zellen mit einem ZOE Fluorescent Cell Imager (Bio-Rad) sichtbar gemacht. Der Zelltod wurde quantifiziert und als Prozentsatz der PI-positiven Zellen an der Gesamtzahl der Zellen (Hoechst-gefärbte Zellen) ausgedrückt.

Escherichia coli DH5α wurde über Nacht in BHI-Medium gezüchtet, dann am folgenden Tag 1:100 in BHI verdünnt und weitere 2 Stunden bei 37 °C bis zur exponentiellen Phase gezüchtet. Anschließend wurde 1 ml der Bakterienkultur durch 2-minütige Zentrifugation bei 5.000 g gesammelt und in Puffer B resuspendiert, bis eine endgültige Bakterienzelldichte von 5 × 108 ml–1 erreicht wurde. Für den Abtötungstest wurden 5 μl Bakterien zu einer 15 μl-Reaktion hinzugefügt, die 10 μM GSDMB voller Länge in Abwesenheit oder Gegenwart von GZMA enthielt. Die Reaktionen wurden 2 Stunden lang bei 37 °C durchgeführt. Nach der Inkubation wurden 5 μl der behandelten Bakterien in 200 μl BHI in 96-Well-Platten mit flachem Boden ausgesät. Das Bakterienwachstum wurde durch Ablesen der Absorption bei 600 nm über 6 Stunden mit einem SpectraMax M5-Plattenlesegerät (Molecular Devices) überwacht. Die Anzahl der wiederhergestellten koloniebildenden Einheiten (KBE) wurde durch Normalisierung der OD600 behandelter Bakterien (mit GZMA in Reaktionen) auf unbehandelte Bakterien (Puffer oder ohne GZMA) berechnet.

Den vorbereiteten Liposomen wurde gereinigte GSDMB-Isoform 1 zugesetzt, gefolgt von der Zugabe von 3C-Protease, um die Porenbildung zu initiieren. Die Reaktion lief 3 Stunden lang auf Eis ab. Mit GSDMB-Poren beladene Liposomen wurden mit 2 % C12E8 (Anatrace) solubilisiert, um Poren zu extrahieren. Um sich schlecht verhaltende Partikel und GSDMB-C zu entfernen, wurden die Proben mit einer Superose 6 (10/300)-Größenausschlusssäule (Cytiva), äquilibriert mit Puffer B (25 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl und 0,006 % C12E8), weiter gereinigt. .

Zur Negativfärbung wurden 10 μl des GSDMB-IpaH7.8-Komplexes oder der GSDMB-Pore auf ein glimmentladenes, kohlenstoffbeschichtetes Kupfergitter (Electron Microscopy Sciences) aufgetragen. Die Probe wurde 1 Minute lang auf dem Gitter inkubiert, 1 Minute lang mit 1 % Uranylacetat gefärbt und trockengetupft. Die Gitter wurden auf einem Hitachi H-7650 Transmissionselektronenmikroskop abgebildet, das mit einer 2k-CCD-Kamera (Advanced Microscopy Techniques) in der UCONN Health Electron Microscopy Facility ausgestattet war.

Für den GSDMB-IpaH7.8-Komplex wurden 3,5 μl frisch gereinigte Probe mit 0,5 mg ml–1 mit einem Vitrobot Mark auf plasmaglimmentladene Quantifoil-Lochkupfergitter (R 1,2/1,3, 400 Mesh, Electron Microscopy Sciences) aufgetragen IV (Thermo Fisher Scientific) eingestellt auf Blotting-Stärke 4, Blotting-Zeit 5,5 s, 100 % Luftfeuchtigkeit und 4 °C. Die befleckten Gitter wurden sofort in flüssiges Ethan getaucht und zur Lagerung in flüssigen Stickstoff überführt. Ein Kryo-EM-Datensatz wurde in der Kryo-EM-Einrichtung der Case Western Reserve University auf einem Titan-Krios-Elektronenmikroskop (Thermo Fisher Scientific) gesammelt, das mit einem K3 Summit-Direktelektronendetektor (Gatan) und einem Nachsäulen-Energiefilter (Gatan) ausgestattet ist Zählmodus mit serialEM. Insgesamt wurden 3.128 Filme mit Defokuswerten im Bereich von –0,8 bis –2,5 μm bei 105.000-facher Vergrößerung und einer Pixelgröße von 0,414 Å aufgenommen. Für jeden Film wurden 58 Bilder über einen Zeitraum von 5,25 s mit einer ungefähren Gesamtdosis von 66,95 e− Å–2 aufgenommen.

Für GSDMB-Poren wurden durch Reinigungsmittel gelöste GSDMB-Poren auf 0,6 mg ml–1 konzentriert und dann auf Quantifoil-Lochkupfergittern eingefroren, die mit einem ultradünnen Kohlenstofffilm (R 1,2/1,3, 400 Mesh, Electron Microscopy Sciences) beschichtet waren. Kurz gesagt wurde ein 3-μl-Tropfen der GSDMB-Porenprobe auf ein durch Plasmaglühen entladenes Spitzenkohlenstoffgitter aufgetragen, das auf einem Vitrobot montiert war. Anschließend wurde das Gitter nach einer Wartezeit von 2 s 6 s lang bei einer Blotting-Kraft von 10 mit Filterpapier geblottet. Luftfeuchtigkeit und Temperatur im Vitrobot wurden während des gesamten Betriebs auf 100 % bzw. 4 °C eingestellt. Das geblotete Gitter wurde dann in flüssiges Ethan getaucht und zur Lagerung in flüssigen Stickstoff überführt. Der Kryo-EM-Datensatz wurde in der Kryo-EM-Einrichtung an der Chan Medical School der University of Massachusetts auf einem Titan Krios-Elektronenmikroskop (Thermo Fisher Scientific) gesammelt, das mit einem K3 Summit-Direktelektronendetektor (Gatan) und einem Nachsäulen-Energiefilter ausgestattet ist (Gatan). Im Zählmodus wurden insgesamt 6.376 Filme gesammelt, die jeweils 50 Bilder und eine Gesamtbelichtungsdosis von 50 e–1 Å–2 enthielten. Die Vergrößerung wurde auf 105.000 eingestellt, die Pixelgröße betrug 0,83 Å und der Defokussbereich –1,0 bis –2,0 μm.

Rohfilme wurden durch Verstärkungsreferenz und auf strahlinduzierte Bewegung korrigiert und mit MotionCor2 (Ref. 39) zu bewegungskorrigierten Bildern summiert. CTF-Parameter wurden mit CTFFind4 (Ref. 40) bestimmt und später in cryoSPARC41 verfeinert.

Für den GSDMB-IpaH7.8-Komplex wurden die Koordinaten (insgesamt 1.522.742 Partikel) nach der Partikelauswahl mit dem allgemeinen Modell in crYOLO42 zur anschließenden Verarbeitung an cryoSPARC übertragen. Es wurden mehrere Runden der 2D-Klassifizierung durchgeführt, um Eis, Kohlenstoffkanten und falsch positive Partikel mit Rauschen zu eliminieren. Häufig vorkommende Klassen mit 307.276 Partikeln wurden ausgewählt und einer Ab-initio-3D-Rekonstruktion mit anschließender heterogener Verfeinerung unterzogen. Die optimale Klasse mit 113.959 Partikeln wurde für eine homogene und ungleichmäßige Verfeinerung ausgewählt43. Die Auflösung der endgültigen Elektronendichtekarte wurde auf 3,8 Å geschätzt, basierend auf dem Goldstandard-Fourier-Shell-Korrelationskriterium (FSC) von 0,143 (Lit. 44). Die lokale Auflösungsverteilung der Karte wurde von ResMap45 bestimmt. Zur Erstellung der Abbildungen wurde die in cryoSPARC geschärfte Dichtekarte verwendet.

Für GSDMB-Poren wurden zunächst insgesamt 692.212 Partikel durch manuelles und automatisiertes Partikelpicken in cryoSPARC extrahiert. In cryoSPARC wurde eine zweidimensionale Klassifizierung durchgeführt, um Eis, Kohlenstoffkanten und falsch positive Partikel mit Rauschen zu eliminieren. Nach der 2D-Klassifizierung wurden 156.037 Partikel zur 3D-Klassifizierung in Relion-4.0 importiert, wobei ein erstes Modell de novo in cryoSPARC unter Verwendung desselben Partikelsatzes generiert wurde. Für die erste Runde der 3D-Klassifizierung wurde die C1-Symmetrie verwendet. 3D-Klassen mit relativ klaren Merkmalen der C24-Symmetrie wurden für eine zusätzliche Runde der 3D-Klassifizierung mit C24-Symmetrie ausgewählt, um schlechte Partikel auszusortieren. Als nächstes wurden 41.799 Partikel aus der 3D-Klasse mit optimaler Auflösung zur ungleichmäßigen Verfeinerung zurück in cryoSPARC importiert. Bei C24-Symmetrie betrug die Auflösung der GSDMB-Porenkarte 4,96 Å, gemessen mit dem Goldstandard FSC von 0,143. Die Fokusverfeinerung mit einer Maske, die die β-Barrel-Region ausschließt, verbesserte die lokale Auflösung der GSDMB-Globulardomäne auf 4,48 Å.

Atommodelle sowohl des IpaH7.8-GSDMB-Komplexes als auch der GSDMB-Pore wurden erstellt und mithilfe von Coot46 und PHENIX47 in Kryo-EM-Dichte verfeinert. Für den IpaH7.8-GSDMB-Komplex wurden von AlphaFold2 vorhergesagte Strukturen von IpaH7.8 und GSDMB als Ausgangsmodelle verwendet . Modelle von IpaH7.8 und GSDMB wurden als starrer Körper in UCSF Chimera48 an die EM-Dichte angedockt und dann manuell in Coot angepasst. Das Strukturmodell des Komplexes wurde mithilfe von „phenix.real_space_refine“ mit sekundären Strukturbeschränkungen und Coot iterativ weiter verfeinert. Die Qualität des Atommodells wurde von Molprobity49 bewertet. Für GSDMB-Poren wurde die Struktur von GSDMB im IpaH7.8-GSDMB-Komplex als Ausgangsmodell verwendet. Anschließend wurde ein ähnliches Verfahren zur weiteren Anpassung und Verfeinerung durchgeführt. Die Abbildungen wurden mit PyMOL (Schrödinger) und UCSF Chimera erstellt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die Atomkoordinaten des GSDMB-IpaH7.8-Komplexes, der GSDMB-Poren und der GSDMB-Poren ohne β-Fass wurden in der Proteindatenbank (PDB) unter den Zugangsnummern hinterlegt. 8EFP, 8ET2 bzw. 8ET1. Die zugehörigen Kryo-EM-Dichtekarten wurden in der Electron Microscopy Data Bank unter den Zugangsnummern hinterlegt. EMD-28087, EMD-28584 bzw. EMD-28583. Alle weiteren Daten sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich. Mehrere Strukturkoordinaten in der in dieser Studie verwendeten PDB-Datenbank können anhand der Zugangsnummern lokalisiert werden. 6CB8, 5B5R, 6N9O, 6N9N, 6VFE, 7V8H und 3CVR.

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Referenzen herunterladen

Wir danken S. Dou (QuintaraCT, Inc.), X. Li und Y. Wang für die Diskussionen. Diese Arbeit wurde vom UConn Health Start-up Fund und den US National Institutes of Health unterstützt (Zuschussnummern R01AI158435 an JR und R01AI119015 an VAR).

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Sonia Shivcharan, Tian Tian, ​​Skylar Wright

Abteilung für Immunologie, School of Medicine, University of Connecticut Health Center, Farmington, CT, USA

Chengliang Wang, Sonia Shivcharan, Tian Tian, ​​​​Skylar Wright, Danyang Ma, Vijay A. Rathinam und Jianbin Ruan

Abteilung für Biochemie und Molekulare Biotechnologie und Kryo-Elektronenmikroskopie-Kerneinrichtung, Chan Medical School der Universität von Massachusetts, Worcester, MA, USA

JengYih Chang, Kangkang Song & Chen Xu

Kryo-Elektronenmikroskopie-Kern, Case Western Reserve University School of Medicine, Cleveland, OH, USA

Kunpeng Li

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JR und CW konzipierten die Studie. CW-, TT- und DM-exprimierte und gereinigte Proteine. CW rekonstituierte GSDMB-Poren. CW überprüfte Gitter und sammelte Kryo-EM-Daten, unterstützt von JC, KL, KS und CXCW und JR bestimmte Kryo-EM-Strukturen. CW und JR führten biochemische Experimente durch. SS, TT, SW und CW führten zelluläre Experimente durch. JR und VAR betreuten das Projekt. Alle Autoren organisierten und analysierten die Daten. JR und CW haben das Papier mit Beiträgen aller Autoren verfasst.

Korrespondenz mit Jianbin Ruan.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

a, Gelfiltrationsprofil und Coomassie-Blau-gefärbte SDS-PAGE des GSDMB-IpaH7.8-Komplexes. Ergebnisse repräsentativ für mehr als 3 unabhängige Experimente. b, Ein kurzes Flussdiagramm der Einzelpartikel-Kryo-EM-Datenerfassung und des Prozesses. c, Kryo-EM-Karte (oberes Feld) und lokale Auflösungsschätzung (unteres Feld) des GSDMB-IpaH7.8-Komplexes, berechnet mit ResMap. Die höchste Auflösung wird bei der IpaH7.8-LRR-Domäne und der GSDMB-N-Domäne beobachtet. GSDMB-C weist eine relativ geringe Auflösung auf. d, Die Goldstandard-Fourier-Shell-Korrelationskurve (FSC) für die Gesamtkarte und die Modell-zu-Karte-Korrelationen des GSDMB-IpaH7.8-Komplexes.

a, Strukturvergleich von GSDMB-C im IpaH7.8-GSDMB-Komplex und der berichteten Kristallstruktur (PDB: 5TJ2). Die Farben wechseln von Blau am N-Terminus zu Rot am C-Terminus. b, Strukturbasiertes Sequenz-Alignment von menschlichen GSDMs und Maus-GSDMD. Zuvor berichtete Kristallstrukturen von hGSDMD (PDB: 6N9O) und mGSDMD (PDB: 6N9N) sowie von AlphaFold2 vorhergesagte Strukturen von menschlichem GSDMA (hGSDMA), menschlichem GSDMC (hGSDMC) und menschlichem GSDME (hGSDME) werden mithilfe von PROMALS3D mit GSDMB abgeglichen. Sekundäre Strukturelemente von GSDMB sind oberhalb der Sequenz angegeben. Der Interdomänenlinker und die C-terminale Subdomäne sind ebenfalls angegeben. Die beiden mit IpaH7.8 interagierenden Strukturelemente sind durch rote bzw. grüne Kästchen gekennzeichnet. Die drei negativ geladenen Reste in der α1-β'-Schleife werden durch rote Punkte angezeigt, und die Arginin-Insertion (mR20) in Maus-GSDMD wird durch ein blaues Dreieck angezeigt.

a, Eine Nahaufnahme von Interaction Patch I im GSDMB-IpaH7.8-Komplex. GSDMB wird als Banddiagramm dargestellt. Zwei negativ geladene Reste sind als Stäbchen dargestellt. IpaH7,8 wird als elektrostatisches Potential dargestellt. Der Abstand zwischen den beiden kleinen Grundtaschen, die durch R186 und H209 gebildet werden, und den umgebenden Resten in IpaH7.8 ist markiert. b, Sequenzausrichtung der LRR-Domänen von Shigella-IpaHs. Sekundäre Strukturelemente sind oberhalb der Sequenz angegeben. Universell konservierte Reste sind rot markiert und teilweise konservierte Reste sind rot gefärbt. Rückstände, die an Interface Patch II und I beteiligt sind, werden durch rote Punkte bzw. grüne Dreiecke angezeigt. c, Immunoblots von 293T-Zellen, die mit FLAG-markiertem GSDMB und HA-IpaH7.8 (WT oder angegebene Mutanten) co-transfiziert wurden. Ergebnisse repräsentativ für 3 unabhängige Experimente.

a–c, ITC-basierte Messung der Bindungsaffinitäten von IpaH7.8 mit GSDMB (a), menschlichem (hGSDMD) (b) bzw. Maus-GSDMD (mGSDMD) (c). Kd, Dissoziationskonstante; N, die Stöchiometrie des Komplexes. DP, von der ITC-Maschine gemessene Differenzleistung; ΔH, von der ITC-Maschine gemessene Wärmeänderung. Dargestellt ist der Mittelwert ± SD (n = 3). d–f, Gelfiltrationsprofile und mit Coomassie-Blau gefärbte SDS-PAGEs von IpaH7.8, inkubiert mit GSDMB (d), menschlichem GSDMD (hGSDMD) (e) oder Maus-GSDMD (mGSDMD) (f). Ergebnisse repräsentativ für mehr als 3 unabhängige Experimente. g,h, Gelfiltrationsprofile IpaH7.8, inkubiert mit GSDMB- (g) bzw. humanen GSDMD-D17S/R20Ins-Mutanten (h). Ergebnisse repräsentativ für 3 unabhängige Experimente. i, Eine Nahaufnahme der Schnittstelle zwischen IpaH7.8 und GSDMs. Strukturen von menschlichem GSDMA (hGSDMA; AlphaFold2 vorhergesagt), menschlichem GSDMC (hGSDMC; AlphaFold2 vorhergesagt), menschlichem GSDMD (PDB: 6N9O), menschlichem GSDME (hGSDME; AlphaFold2 vorhergesagt) und Maus-GSDMD (PDB: 6N9N) werden in GSDMB überlagert die Struktur des GSDMB-IpaH7.8-Komplexes. Dargestellt sind die Aminosäuresequenzen des β3-Strangs, der mit IpaH7.8 von jedem GSDM interagiert. j, Coomassie-Blau-gefärbte SDS-PAGE der In-vitro-Ubiquitinierung von GSDMD von Menschen und Mäusen (WT und angegebene Mutanten). mβ3 ersetzt den β3-Strang in menschlichem GSDMD durch die entsprechende Maussequenz. GSDMBβ3 ersetzt den β3-Strang in Maus-GSDMD durch die entsprechende GSDMB-Sequenz. Mutationen veränderten die Ubiquitinierung in vitro nicht. Ergebnisse repräsentativ für 3 unabhängige Experimente.

a: Gelfiltrationsprofile zeigen keine Wechselwirkung zwischen GSDMB und der IpaH7.8-Y165E/Y166E-Mutante oder der IpaH7.8-R186E/R228D-Mutante. Ergebnisse repräsentativ für mehr als 3 unabhängige Experimente. b, Die Fähigkeit von GSDMB, bei Inkubation mit IpaH7.8 (WT) in verschiedenen Dosen ein Austreten von Liposomen zu induzieren. Jeder Punkt stellt den Mittelwert ± SD von 3 technischen Replikaten dar. c, GSDMB-Assoziation mit CL-Liposomen in Gegenwart von IpaH7.8 in einem Liposomensedimentationstest. FL: in voller Länge; N: N-terminale Domäne; und C: C-terminale Domäne. SDS-PAGEs wurden mit Coomassie-Blau gefärbt. Ergebnisse repräsentativ für 3 unabhängige Experimente. d, Die Fähigkeit von menschlichem GSDMD, in Gegenwart von IpaH7.8 in verschiedenen Dosen einen Liposomenaustritt von CL-Liposomen zu induzieren. Jeder Punkt stellt den Mittelwert ± SD von 3 technischen Replikaten dar. e, Liposomen-Sedimentationstest, der die Assoziation von menschlichem GSDMD mit CL-Liposomen in Gegenwart von IpaH7.8 zeigt. Ergebnisse repräsentativ für 3 unabhängige Experimente. f, Liposomensedimentationstests zeigen die Assoziation von ubiquitiniertem oder nicht ubiquitiniertem humanem GSDMD mit CL-Liposomen. Ergebnisse repräsentativ für 3 unabhängige Experimente. g, Liposomenleckagetests zeigen die Wirkung der Ubiquitinierung bei der Hemmung der porenbildenden Aktivitäten von menschlichem GSDMD. Die Daten wurden mit der nach Zugabe des Detergens beobachteten Fluoreszenz normalisiert und unmittelbar vor der Proteinzugabe auf Null der Fluoreszenz gesetzt. Jeder Punkt stellt den Mittelwert ± SD von 3 technischen Replikaten dar. h, In-vitro-Ubiquitinierung von GSDMB-Mutanten mit zu Argininen mutierten Lysinen. 3R, wobei K177, K192 und K192 in GSDMB zu Argininen mutiert sind. SDS-PAGEs wurden mit Coomassie-Blau gefärbt. Ergebnisse repräsentativ für 3 unabhängige Experimente.

Sekundäre Strukturelemente von GSDMB und menschlichem GSDMD (PDB: 6VFE) sind oberhalb bzw. unterhalb der Sequenz angegeben. Die beiden Transmembranhaarnadeln sind in orangefarbenen Kästchen hervorgehoben. Alle Lysine sowohl in GSDMB als auch im menschlichen GSDMD sind blau gefärbt. Lysine, von denen vorhergesagt wurde, dass sie an der Porenbildung beteiligt sind, und die in unserer Studie auf Ubiquitinierung untersucht wurden, sind in blauen Kästchen hervorgehoben. Die „kanonische“ Sequenz im GSDMB-Interdomänenlinker wird in einem grünen Kästchen hervorgehoben. Die Reste im Interdomänenlinker, die die Porenoligomerisierung und Lipidbindung vermitteln können, sind in roten gestrichelten Kästchen bzw. mit blauem Hintergrund hervorgehoben.

a, In-vitro-Ubiquitinierung von GSDMB-Isoformen durch Shigella IpaH7.8. Als nicht ubiquitinierte Negativkontrollen wurden Ubiquitinierungsreaktionen verwendet, die bei 0 Minuten durch Kochen mit SDS-PAGE-Ladepuffer beendet wurden. SDS-PAGE wurde mit Coomassie-Blau gefärbt. Ergebnisse repräsentativ für 3 unabhängige Experimente. b, Wirkung der Ubiquitinierung auf die Hemmung der porenbildenden Aktivitäten der GSDMB-Isoform 6, gezeigt durch einen Liposomen-Leakage-Assay unter Verwendung von CL-Liposomen. Jeder Punkt stellt den Mittelwert ± SD von 3 technischen Replikaten dar. c, Spaltung von GSDMB-Isoformen durch GZMA. 3,6 μg GSDMB-Isoformen wurden mit jeweils 1 μg GZMA inkubiert. Die Spaltung erfolgte durch Inkubation der Mischung bei 37 °C für 2 Stunden. Weißes * zeigt GSDMB-NT an. Das Molekulargewicht von GSDMB-NT der Isoform 2 (25,9 kDa) liegt sehr nahe am GZMA (25,8 kDa) und kann auf der SDS-PAGE nicht getrennt werden. SDS-PAGE wurde mit Coomassie-Blau gefärbt. Ergebnisse repräsentativ für 3 unabhängige Experimente. d, Wirkung von GSDMB-Isoformen bei der Induktion von Pyroptose in HEK293T-Zellen. FL: GSDMB in voller Länge; NT: N-terminale Domäne von GSDMB. Der Maßstabsbalken beträgt 100 μm. Ergebnisse repräsentativ für 3 unabhängige Experimente. e, Wirkung von IpaH7.8 bei der Hemmung des GSDMB-Isoform-4-vermittelten pyroptotischen Zelltods von HEK293T-Zellen. Ergebnisse repräsentativ für 3 unabhängige Experimente. Der Maßstabsbalken beträgt 100 μm. f, Quantifizierung des Zelltods in (e). Fehlerbalken, Mittelwert ± SD von 3 unabhängigen Experimenten. Einweg-ANOVA, gefolgt von Tukeys Post-hoc-Test im Vergleich zur Kontrolle von HEK293T-Zellen, die mit Plasmiden von GSDMB-NT und leerem Vektor transfiziert wurden. ** p < 0,005. g, Wirkung von GSDMB-Isoformen bei der Hemmung des Bakterienwachstums. Fehlerbalken, Mittelwert ± SD von 3 unabhängigen Experimenten. Einfaktorielle ANOVA, gefolgt von Tukeys Post-hoc-Test mit Proben im Vergleich zu ihren ungespaltenen Kontrollen. *, p < 0,1, ***, p < 0,001, NS: nicht signifikant.

a, Repräsentative negative Färbe-EM-Bilder von Poren der GSDMB-Isoformen 4 und 6, extrahiert aus Cardiolipin-Liposomen unter Verwendung des Detergens C12E8. Maßstabsleiste: 50 nm. Ergebnisse repräsentativ für mehr als 3 unabhängige Experimente. b, Ein repräsentatives negatives EM-Färbungsbild von GSDMB-Isoform-1-Poren, gelöst in C12E8 (linkes Feld) und ein Kryo-EM-Bild von GSDMB-Isoform-1-Poren, aufgenommen mit einem Titan-Krios-Mikroskop, das mit einer K3-Kamera ausgestattet ist. Ergebnisse repräsentativ für mehr als 3 unabhängige Experimente. Maßstabsleiste: 50 nm. c, Ein kurzes Flussdiagramm der Kryo-EM-Datenerfassung einzelner Partikel und des Prozesses des GSDMB-Porendatensatzes. d, Die Goldstandard-Fourier-Shell-Korrelationskurve für die Halbkartenkorrelationen der GSDMB-Pore.

a, Die Goldstandard-FSC-Kurve für die GSDMB-Vorpore. b, Die Kryo-EM-Karte (links) und die mit einem Atommodell angepasste Kryo-EM-Karte (rechts) der 24-fachen GSDMB-Präpore. GSDMB-Protomer sind unterschiedlich gefärbt. GSDMB-Prepore verfügt nicht über die Transmembran-Insertionsregion. Rot gestrichelte Kästchen zeigten die fehlende Transmembranregion an. c, GSDMB-Poren-β-Haarnadelbildung (HPs). Die β3-β5-Region der ersten Erweiterungsdomäne (ED1) wandelt sich in HP1 um. Die Region β7-α4-β8 stellt ED2 dar und wird zu HP2. d, Zwei benachbarte Untereinheiten in der GSDMB-Pore. Strukturelemente, die an der Oligomerisierung beteiligt sind, sind markiert und gelb gefärbt. e,f, Kryo-EM-Dichten des Interdomänenlinkers in der hGSDMD-Pore (e) bzw. der GSDMB-Pore (f). Die Gesamtdichten sind grau gefärbt, wobei die Dichten der Interdomänenlinker in den hGSDMD- und GSDMB-Poren rosa bzw. magenta gefärbt sind. Die Interdomänenlinker sind rot gefärbt. g: Eine Nahaufnahme der Interdomänen-Linker-Region 1 in der GSDMB-Isoform 1. Die Helix α3' der benachbarten Untereinheit, die mit dem Interdomänen-Linker interagiert, ist gelb gefärbt. h, Auswirkung der Mutation der Region 1 im Interdomänenlinker der GSDMB-Isoformen 1 und 4 auf die Induktion des Austretens von Liposomen (10 % PS). Jeder Punkt stellt den Mittelwert ± SD von 3 technischen Replikaten dar. WT: Wildtyp GSDMB; Region 1: Mutation des Motivs der Region 1 zu „GGGG“ in GSDMB. i, j, HEK293T-Zellen wurden 24 Stunden lang vorübergehend mit den angegebenen Konstrukten von GSDMB-Isoform 4 (i) und hGSDMD (j) transfiziert und mit Hoechst 33342 und PI angefärbt. FL: volle Länge; NTWT: Wildtyp GSDMB/D-NT; NTBS4: GSDMB/D-NT, das eine dreifache Mutation der drei basischen Reste in der GSDMB-Isoform 4 und in hGSDMD zu Glutaminsäuren in BS4 enthält. Ergebnisse repräsentativ für 3 unabhängige Experimente. Der Maßstabsbalken beträgt 100 μm.

Diese Datei enthält die nicht zugeschnittenen Immunoblots (Ergänzende Abbildungen 1 und 2).

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Nachdrucke und Genehmigungen

Wang, C., Shivcharan, S., Tian, ​​T. et al. Strukturelle Basis für die GSDMB-Porenbildung und deren Targeting durch IpaH7.8. Natur 616, 590–597 (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-023-05832-z

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Eingegangen: 18. Oktober 2022

Angenommen: 13. Februar 2023

Veröffentlicht: 29. März 2023

Ausgabedatum: 20. April 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-023-05832-z

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